猪圆环病毒3型阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用

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作者 侯佳璐 任静 +5 位作者 王亚文 袁晨 马天天 杨柳 李清艳 宋勤叶 《中国动物检疫》 2025年第3期91-100,共10页

为建立猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)阻断ELISA抗体检测方法,应用大肠杆菌表达系统表达PCV3衣壳(capsid,Cap)蛋白,制备了2株Cap蛋白单克隆抗体(1D8和3B5),测定了单克隆抗体的解离常数(dissociation constant,KD);选择... 为建立猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)阻断ELISA抗体检测方法,应用大肠杆菌表达系统表达PCV3衣壳(capsid,Cap)蛋白,制备了2株Cap蛋白单克隆抗体(1D8和3B5),测定了单克隆抗体的解离常数(dissociation constant,KD);选择亲和力高的1D8用辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)标记,然后基于Cap蛋白和HRP标记的单克隆抗体1D8建立了PCV3阻断ELISA抗体检测方法。结果显示:当血清阻断率(present inhibition,PI)≥29.3%时,判定PCV3抗体阳性;当血清PI<23.4%时,判定PCV3抗体阴性;当23.4%≤PI<29.3%时,判为可疑。建立的方法与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒等病原抗血清无交叉反应;检测敏感性为1:160,批内和批间重复试验的变异系数分别为0.87%~6.64%和1.03%~9.33%,与Western-blot检测的符合率为95.5%。用建立的阻断ELISA方法检测2021—2024年间从河北省部分猪场采集的205份血清,发现PCV3抗体阳性率为28.8%(59/205),其中仔猪、育肥猪、母猪的抗体阳性率分别为30.0%、32.8%和19.5%。结果表明,本研究建立的PCV3阻断ELISA抗体检测方法可用于PCV3感染的血清学诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。 展开更多

关键词 PCV3 CAP蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA 应用

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猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗耐热保护技术的研究 被引量：1

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作者 赵玉龙 何平有 +2 位作者 刘明超 刘涛 焦玉兰 《中国兽药杂志》 2023年第2期12-17,共6页

疫苗保护剂及其冻干工艺是影响疫苗效果的重要因素,对疫苗保存、运输及免疫效果有很大影响。为提高疫苗质量,在常规保护剂(明胶、蔗糖)基础上添加卡波姆、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮等基质,组成新型保护剂,分别在病毒液保存和疫苗冻干过... 疫苗保护剂及其冻干工艺是影响疫苗效果的重要因素,对疫苗保存、运输及免疫效果有很大影响。为提高疫苗质量,在常规保护剂(明胶、蔗糖)基础上添加卡波姆、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮等基质,组成新型保护剂,分别在病毒液保存和疫苗冻干过程添加,并评价其病毒保护效果。结果表明:在半成品病毒液储存时加入10%新型保护剂,可使半成品保存期由原来的2个月延长至12个月。采用新型保护剂制备的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗,溶解性显著优于常规保护剂活疫苗,保存期由原来-20℃保存18个月提高到2~8℃保存36个月,且病毒活性及攻毒保护效力均优于原工艺产品,实现了储运过程中疫苗的冷藏储运,提升了疫苗的应用效果。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎 猪流行性腹泻 二联活疫苗 耐热保护技术

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铁蛋白纳米载体及其在生物医学领域的应用潜力 被引量：2

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作者 苏恺 范葶莉 宋勤叶 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期909-919,共11页

铁蛋白是广泛存在于几乎所有生命体中的储铁蛋白,具有储存和转化铁、维持细胞铁代谢平衡以及保护细胞免受氧化损伤等功能。铁蛋白亚基能够自组装成纳米笼,装载和运输各种金属、药物、显影剂等多种物质,并且铁蛋白具有易被修饰以及良好... 铁蛋白是广泛存在于几乎所有生命体中的储铁蛋白,具有储存和转化铁、维持细胞铁代谢平衡以及保护细胞免受氧化损伤等功能。铁蛋白亚基能够自组装成纳米笼,装载和运输各种金属、药物、显影剂等多种物质,并且铁蛋白具有易被修饰以及良好的生物相容性和靶向性等特点,使其成为生物医学领域应用潜力巨大的非病毒天然纳米材料。本文重点综述了铁蛋白的结构和生物学功能,以及基于铁蛋白搭建的纳米载体平台在疾病检测、纳米疫苗和药物载体等领域的研究进展及应用前景,旨在为基于铁蛋白纳米颗粒的相关研究提供参考。 展开更多

关键词 铁蛋白 纳米载体 结构与功能 生物医药 应用潜力

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非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析 被引量：1

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作者 李艳蕊 任静 +6 位作者 崔锦蔷 袁晨 王云霄 马亚娟 刘志昌 李永社 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1660-1670,共11页

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组... 【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P<0.05)。【结论】本研究表达了ASFV CD2v蛋白胞内域和胞外域,前者的抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) CD2v蛋白 胞外域 胞内域 蛋白表达 抗原性

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3种消毒剂对猪场4种常见细菌的杀菌效果试验

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作者 王文钊 李妍 +7 位作者 代飞 王敬友 顾文源 张帅 赵云环 任晓祥 范京惠 左玉柱 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期139-144,共6页

为了研究聚六亚甲基双胍盐酸盐、过硫酸氢钾复合物、戊二醛-癸甲溴铵在不同作用浓度、不同作用时间对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的灭活效果,为猪场选用消毒剂提供参考。采用悬液定量杀菌试验方法,研究3种消毒剂... 为了研究聚六亚甲基双胍盐酸盐、过硫酸氢钾复合物、戊二醛-癸甲溴铵在不同作用浓度、不同作用时间对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的灭活效果,为猪场选用消毒剂提供参考。采用悬液定量杀菌试验方法,研究3种消毒剂在不同作用浓度、不同作用时间对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的灭活效果。结果显示,以杀菌对数值5.00作为评价标准来判断,聚六亚甲基双胍盐酸盐在500mg/L、5min内对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的杀灭对数值>5.00;过硫酸氢钾复合物在2000mg/L、5min内对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的杀灭对数值>5.00;戊二醛-癸甲溴铵在2000mg/L、10min内对葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的杀灭对数值>5.00,大肠埃希氏菌杀灭效果评测试验中,在试验浓度和时间中没有结果显示杀灭对数值5.00。结果表明除了戊二醛-癸甲溴铵对大肠埃希氏菌的杀灭效果相对较差外,3种消毒剂在试验浓度下均具有良好的杀灭细菌繁殖体效果。 展开更多

关键词 聚六亚甲基双胍盐酸盐 过硫酸氢钾复合物 戊二醛-癸甲溴铵 灭菌效果

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新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

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作者 王玮珠 王俊丽 +7 位作者 李丽杰 雷白时 孙茂源 张武超 赵卓 赵款 袁万哲 王林 《中国兽药杂志》 2024年第11期1-8,共8页

为建立一种高效、便捷的新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)抗体检测方法,以大肠杆菌表达系统表达的重组σB蛋白作为包被抗原,建立了NDRV抗体的间接ELISA检测方法。对该检测方法的反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性和重... 为建立一种高效、便捷的新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)抗体检测方法,以大肠杆菌表达系统表达的重组σB蛋白作为包被抗原,建立了NDRV抗体的间接ELISA检测方法。对该检测方法的反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。结果显示建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:0.5μg/mL抗原4℃包被过夜,待检血清1∶400稀释37℃孵育60 min,显色时间为15 min,Cut off值为0.432。该方法对新城疫病毒(NDV)、鸭圆环病毒(DuCV)、新型鹅细小病毒(NGPV)和鸭坦布苏病毒(DTMUV)阳性血清均不存在交叉反应,且检测阳性血清的敏感度为1∶6400,批间和批内重复试验的变异系数均小于8%,该检测方法与市售NDRV抗体ELISA检测试剂盒的总符合率为96.88%。本研究成功建立了间接ELISA检测方法,为NDRV抗体检测提供了有效便捷的方法。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 σB蛋白 原核表达 间接ELISA

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金雀异黄酮纳米固体分散体的制备及特性研究

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作者 张彦翠 邱晨旭 +2 位作者 高建亭 王飞 赵兴华 《动物医学进展》 北大核心 2024年第5期61-67,共7页

为提高金雀异黄酮(genistein,GEN)的溶解度,选用聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)K30为载体,采用旋转蒸发法制备金雀异黄酮纳米固体分散体(GEN-PVP K30 SD);通过粉末X射线衍射、差示扫描量热和体外溶出试验筛选最佳比例;利用... 为提高金雀异黄酮(genistein,GEN)的溶解度,选用聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)K30为载体,采用旋转蒸发法制备金雀异黄酮纳米固体分散体(GEN-PVP K30 SD);通过粉末X射线衍射、差示扫描量热和体外溶出试验筛选最佳比例;利用傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜和动态光散射对固体分散体进行表征,并进行稳定性研究。结果显示,在粉末X射线衍射和差示扫描量热分析中,不同药载比(1∶3、1∶5、1∶7、1∶9)的旋蒸样品均无GEN晶体特征峰和吸热峰,表明GEN以无定形态分散于载体,固体分散体制备成功;GEN的累积溶出率仅为0.17%,不同药载比固体分散体的累积溶出率分别为20%、46%、82%、99%;药载比1∶9的样品黏度大,因此最佳选择为药载比1∶7。红外结果显示,GEN与载体间产生了氢键;GEN-PVP K30 SD为不规则的块状结构,粒径为156 nm±3 nm,且GEN-PVP K30 SD在180 d内稳定性良好。结果表明,通过旋转蒸发法成功制备了金雀异黄酮纳米固体分散体,累积溶出率显著高于GEN。 展开更多

关键词 金雀异黄酮 固体分散体 纳米 聚乙烯吡咯烷酮 累积溶出率

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泰万菌素对猪繁殖与呼吸综合征的防控效果试验 被引量：8

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作者 张帅 刘媛 +4 位作者 王迈 谷建辉 赵云环 刘莹 左玉柱 《中国动物检疫》 CAS 2022年第4期113-119,共7页

为检验泰万菌素对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的防控效果,用2种泰万菌素制品(A、B)和黄芪多糖饲喂妊娠母猪,通过统计临床生产指标、母猪和仔猪抗体水平、病毒检出率以及细胞因子IL-2、IFN-γ表达水平等,综合评价泰万菌素的PRRS防控效果。... 为检验泰万菌素对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的防控效果,用2种泰万菌素制品(A、B)和黄芪多糖饲喂妊娠母猪,通过统计临床生产指标、母猪和仔猪抗体水平、病毒检出率以及细胞因子IL-2、IFN-γ表达水平等,综合评价泰万菌素的PRRS防控效果。结果显示:泰万菌素的PRRS防控效果明显优于黄芪多糖,其中泰万菌素A、B组母猪的产健仔率由试验前的84.98%分别提高到94.44%、91.89%,产弱胎、死胎或木乃伊胎率相应降低;泰万菌素A、B组母猪流产率降低,体内抗体下降速率减缓,所产仔猪抗体稳定性和整齐度提高,母猪血液中的PRRS病原检出率和浓度降低,IL-2表达水平下降,IFN-γ表达水平上升。结果表明,泰万菌素可降低妊娠母猪因PRRS造成的繁殖障碍率,同时可通过调控细胞因子水平增强机体免疫力,从而起到防控PRRS的作用。本研究为PRRS防控提供了一种新思路。 展开更多

关键词 泰万菌素 猪繁殖与呼吸综合征 黄芪多糖 妊娠母猪 细胞因子

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非洲猪瘟病毒全长与截短p72蛋白的抗原性比较 被引量：2

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作者 张文燕 王亚文 +6 位作者 冯亚文 滕召剑 李潭清 董炜 刘涛 宋勤叶 任玉红 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期1182-1191,共10页

比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定... 比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定表达的蛋白,分析蛋白的抗原表位;用纯化的重组全长和截短p72蛋白分别免疫小鼠,比较其免疫原性;通过ELISA和Western blot,评价重组p72和p72s蛋白与ASFV阳性血清的免疫反应性。结果:重组p72和p72s蛋白均以包涵体形式表达,相对分子质量分别约为76和42 ku,与预期大小相符;表达蛋白的酶解肽段对p72和p72s蛋白推测氨基酸序列的覆盖度分别为89.3%和88.39%,两者分别包含27和17个抗原表位;用p72与p72s蛋白免疫小鼠3次后,血清特异性抗体效价分别为1∶200~1∶25600和1∶12800~1∶409600;基于重组p72与p72s蛋白的ELISA从108份猪血清中分别检出78份(72.2%)和85份(78.7%)阳性血清,两者的检测结果具有很好的一致性(kappa=0.826,P=0.016);经Western blot检测的10份ASFV抗体阳性血清中有7份与p72蛋白反应,全部与p72s蛋白反应。截短p72蛋白比全长p72蛋白的抗原性好,更适合用于ASFV抗体检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 截短p72蛋白 原核表达 抗原性

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基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：4

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作者 张文燕 王亚文 +5 位作者 袁晨 冯亚文 滕召剑 商佳亮 逯纪成 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第7期2688-2697,共10页

【目的】建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/... 【目的】建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5000;反应条件为:抗原于37℃孵育1 h后经4℃包被酶标板过夜、于37℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为:当待检血清的D_(450 nm)值≥0.365时,判定为阳性;当D_(450 nm)值<0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量(0.110~0.554 mg/mL);批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%(94/124)和32.26%(40/124)。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) 截短p72蛋白 原核表达 间接ELISA

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猪场常见消毒药对非洲猪瘟病毒的消毒效果 被引量：1

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作者 顾文源 张帅 +3 位作者 贾丽娜 赵云环 范京惠 左玉柱 《中国动物检疫》 CAS 2023年第8期103-108,共6页

为做好非洲猪瘟(ASF)防控,保障猪场生物安全措施的有效实施,通过查阅文献分析了多种猪场常见消毒药(火碱、酸、过硫酸氢钾、卤素类和醛类)的特点及使用方法,综述了其对非洲猪瘟病毒(ASFV)的杀灭效果。结果显示:在22℃时,1.0%和0.5%的火... 为做好非洲猪瘟(ASF)防控,保障猪场生物安全措施的有效实施,通过查阅文献分析了多种猪场常见消毒药(火碱、酸、过硫酸氢钾、卤素类和醛类)的特点及使用方法,综述了其对非洲猪瘟病毒(ASFV)的杀灭效果。结果显示:在22℃时,1.0%和0.5%的火碱溶液可将ASFV杀灭;800倍稀释的二氯异氰尿酸钠溶液可在0.5 h杀灭ASFV;1.0%的柠檬酸能够将ASFV减少4个对数单位以上;3.0%的醋酸以及0.1%、0.5%和1.0%的戊二醛溶液均对ASFV有杀灭效果。综上,推荐火碱(0.5%)或二氯异氰尿酸钠(稀释度1:800)用于环境消毒,戊二醛(0.1%~1.0%)用于带猪消毒。本文通过综述猪场常用消毒药对ASFV的消杀效果,为猪场消毒药的选择和使用提供指导,以助于猪场的ASF防控。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 生物安全 消毒药 效果

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牛肺泡表面活性蛋白A的分离纯化及抗菌活性分析

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作者 李楠 张建楼 +4 位作者 张永红 郑志强 霍珊珊 仲飞 翟向和 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期498-505,共8页

旨在分离纯化牛天然肺泡表面活性蛋白A(SP-A)和分析其抗菌活性,首先通过共价交联法制备出可特异吸附SP-A的麦芽糖-Sepharose(MS)胶粒,然后用MS胶粒从牛肺泡洗出液中吸附牛SP-A,从而得到牛SP-A。SDS-PAGE和Western blot检测表明,牛SP-A... 旨在分离纯化牛天然肺泡表面活性蛋白A(SP-A)和分析其抗菌活性,首先通过共价交联法制备出可特异吸附SP-A的麦芽糖-Sepharose(MS)胶粒,然后用MS胶粒从牛肺泡洗出液中吸附牛SP-A,从而得到牛SP-A。SDS-PAGE和Western blot检测表明,牛SP-A单体的相对分子质量为30 ku,二聚体为60 ku。分离纯化的牛SP-A能够凝聚大肠杆菌,表明SP-A具有生物活性。抗菌活性检测结果表明,牛SP-A在体外可明显抑制金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和致病性大肠杆菌的增殖,尤其是对革兰阴性菌的抑制作用更为明显,表明本试验制备的牛天然SP-A具有抗菌活性,这为进一步研究其生物学特性及抗菌和抗病毒活性提供了必要的条件,也为SP-A作为抗菌制剂的研发提供了新的思路。 展开更多

关键词 牛表面活性蛋白A 分离纯化 麦芽糖-Sepharose胶粒 抗菌活性

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3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：12

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作者 王华健 张宁 +7 位作者 杨威 赵志强 李茜 陆安 田勇 何欣 赵兴华 李杰峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期1201-1209,共9页

旨在建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157∶H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌的TaqMan多重荧光定量PCR(qPCR)方法。针对大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因、沙门菌invA基因和产单核细胞李氏杆菌hlyA基因的保守序列分别设计特异... 旨在建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157∶H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌的TaqMan多重荧光定量PCR(qPCR)方法。针对大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因、沙门菌invA基因和产单核细胞李氏杆菌hlyA基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行特异性、灵敏性和重复性试验,应用建立的方法检测生鲜食品中致病菌并与国家标准方法对比。结果显示:建立的多重qPCR方法特异性好,只扩增3种靶细菌;灵敏性最低检测值均为10^(4) copies·μL^(-1);重复性良好,批内变异系数为0.09%~2.97%,批间变异系数为0.23%~7.82%;对120份生鲜肉样品进行检测对比,两种方法均检出2份大肠杆菌O157∶H7,21份产单核细胞李氏杆菌,多重qPCR方法检出14份沙门菌,比国标法多检出1份,建立的方法可检出所有受污染样品。综上表明,建立的多重qPCR检测方法能快速、准确检测食品中大肠杆菌O157∶H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌,为食品安全提供技术保障。 展开更多

关键词 食源性致病菌 多重荧光定量PCR 检测方法 大肠杆菌O157∶H7 沙门菌 产单核细胞李氏杆菌

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猪流行性腹泻病毒TaqMan检测方法的建立及基于S基因的遗传变异分析 被引量：3

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作者 翟刚 顾文源 +4 位作者 刘涛 刘莹 张帅 范京惠 左玉柱 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期847-854,共8页

旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV)的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件... 旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV)的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了一种应用于猪场筛查PEDV的qPCR方法,并对筛查出的阳性样品S基因扩增测序后进行遗传进化分析。结果显示:该方法的特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及传染型胃肠炎病毒(TGEV)等猪病常见病原均无交叉反应;建立的检测方法对pMD19T-PEDV标准品的最低检测下限为1.09×101拷贝·μL^(-1),比普通PCR灵敏约100倍,敏感性高;组内和组间的变异系数均小于1%,重复性良好。基于S全基因成功克隆出的9条序列分布于GⅡ的两个亚群,克隆的9条序列的核苷酸相似性为96.6%~99.1%;氨基酸的相似性为94.6%~98.7%。结果表明:本研究得到的PEDV流行株与近年来国内分离株的关系较为密切,而与中国目前使用的疫苗株以及欧洲株亲缘关系较远,这表明河北部分地区PEDV当前流行毒株比较复杂且有变异的趋势,提示持续检测PEDV流行毒株变异动态的必要性。本研究不仅为PEDV的临床诊断提供了技术支持,更为进一步掌握PEDV遗传进化规律提供了参考依据。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 qPCR S基因 遗传变异分析

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新型鹅细小病毒感染鸭的肝、胸腺、回肠转录组差异表达分析 被引量：4

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作者 王璐瑶 郝雪飘 +3 位作者 雷白时 赵款 张武超 袁万哲 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期654-657,共4页

旨在探究新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)与宿主细胞相互作用的分子致病机制。本研究采用转录组测序技术对感染NGPV SD株14 d雏鸭的肝、胸腺和回肠进行分析。结果显示:感染组回肠上调基因有78个,下调基因有31个;感染组胸... 旨在探究新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)与宿主细胞相互作用的分子致病机制。本研究采用转录组测序技术对感染NGPV SD株14 d雏鸭的肝、胸腺和回肠进行分析。结果显示:感染组回肠上调基因有78个,下调基因有31个;感染组胸腺上调基因有111个,下调基因有78个;感染组肝中上调基因有128个,下调基因有313个;NGPV感染雏鸭后,胸腺、回肠和肝中的差异表达基因参与免疫效应过程、淋巴细胞介导的免疫等多个免疫相关生物学过程,并在Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号等多条信号通路富集。综上表明:NGPV感染激活了机体免疫反应和宿主细胞的相关抗病毒信号通路。此研究为NGPV的致病机制研究提供了新的线索。 展开更多

关键词 新型鹅细小病毒 短喙侏儒综合征 转录组测序 免疫反应

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阿司匹林丁香酚酯对体外脂多糖诱导小鼠巨噬细胞炎症反应的抑制效应 被引量：3

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作者 刘旭 潘寅川 +3 位作者 杨亚军 刘希望 马宁 李剑勇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期4048-4057,共10页

本文旨在研究阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester,AEE)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)炎症反应的抑制作用及其潜在作用机制。LPS刺激RAW264.7细胞诱导其炎症模型,细胞分为对照组、LPS组、阿司匹... 本文旨在研究阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester,AEE)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)炎症反应的抑制作用及其潜在作用机制。LPS刺激RAW264.7细胞诱导其炎症模型,细胞分为对照组、LPS组、阿司匹林组(aspirin,Asp,150μmol·L^(-1))、丁香酚组(eugenol,Eug,150μmol·L^(-1))、AEE低(75μmol·L^(-1))、中(150μmol·L^(-1))、高剂量(300μmol·L^(-1))组。CCK-8法检测AEE对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性;ELISA法检测各组细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α炎症因子的含量变化;RT-PCR法检测细胞中花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代谢通路关键酶PLA2、COX-2、COX-1、CYP450和5-LOX的mRNA表达量;分子对接研究Asp、Eug、AEE与AA代谢通路关键酶的相互作用。结果表明:1)CCK-8结果显示,AEE浓度在0~350μmol·L^(-1)时,对细胞无毒性;2)ELISA结果表明,与空白对照组比较,LPS组炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达极显著升高(P<0.01);经不同剂量的AEE处理能极显著降低炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α表达水平(P<0.01);在炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8中,与Asp和Eug组比较,等摩尔的AEE与其差别不显著(P>0.05),表明其抗炎效果相似;不同剂量的AEE在炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8之间差异不显著(P>0.05);3)RT-PCR结果表明,与空白对照组比较,LPS组中AA代谢通路关键酶表达极显著升高(P<0.01);经不同剂量的AEE处理能显著降低AA代谢通路关键酶的mRNA表达量(P<0.05);与Asp和Eug组比较,等摩尔量的AEE能够显著降低AA代谢通路关键酶PLA2的表达量(P<0.05);不同剂量的AEE在COX-1、COX-2、5-LOX和CYP450关键酶表达量之间差异不显著(P>0.05);4)分子对接结果显示,AEE与靶蛋白的结合能均低于-20.9 kJ,表明AEE与靶蛋白结合稳定且质量高,且AEE能够与PLA2、COX-2、COX-1、CYP450和5-LOX之间形成氢键。综上,AEE能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应,并且与前体化合物Asp和Eug抗炎作用相似,其可能通过AA代谢通路发挥抗炎作用。 展开更多

关键词 阿司匹林丁香酚酯 RAW264.7细胞 炎症 分子对接

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戊二醛癸甲溴铵弥雾方式对3种病原的消毒试验 被引量：2

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作者 刘濮毓 王文钊 +6 位作者 张帅 李思琪 刘莹 赵云环 王荣申 范京惠 左玉柱 《中国动物检疫》 CAS 2023年第5期115-120,共6页

为探究戊二醛癸甲溴铵弥雾方式对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪链球菌、猪大肠杆菌的临床消毒效果,以实验室条件模拟临床中戊二醛癸甲溴铵弥雾消毒方式,将戊二醛癸甲溴铵和悬浮增效剂以弥雾形式喷雾到所消毒的空间内,对涂布了PRRS... 为探究戊二醛癸甲溴铵弥雾方式对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪链球菌、猪大肠杆菌的临床消毒效果,以实验室条件模拟临床中戊二醛癸甲溴铵弥雾消毒方式,将戊二醛癸甲溴铵和悬浮增效剂以弥雾形式喷雾到所消毒的空间内,对涂布了PRRSV的培养皿和接种猪链球菌、猪大肠杆菌的血清培养基进行消毒,消毒后将培养皿内病毒洗脱后接种于Marc-145细胞,血清培养基放置在适宜环境培养,观察细胞病变和细菌生长情况,以此判断消毒效果。结果显示:戊二醛癸甲溴铵在空间浓度为2.1 mL/m^(3),消毒时间为30 min时,对PRRSV有一定的消毒作用;当空间浓度为3.5 mL/m^(3),消毒时间为60 min时,可对PRRSV完全灭活;空间浓度为2.1 mL/m^(3),消毒时间为50 min时,对猪链球菌可完全灭活,消毒时间为35 min时,对大肠杆菌可完全灭活。结果表明,戊二醛癸甲溴铵弥雾消毒方式对PRRSV、猪链球菌和猪大肠杆菌有着良好的消毒效果,可应用于猪场日常空舍消毒,对猪场生物安全防控具有重要意义。 展开更多

关键词 戊二醛癸甲溴铵 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪链球菌 猪大肠杆菌

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非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：3

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作者 马天天 张亚楠 +8 位作者 冯亚文 岳怀宁 王亚文 苏恺 袁晨 逯纪成 孙泰然 薛文阁 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2832-2842,共11页

【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白单克隆抗体,为ASFV检测方法的研究提供重要试验材料。【方法】应用大肠杆菌表达重组ASFV p30蛋白,并用该蛋白免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠,应用细胞融合技术将免疫小... 【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白单克隆抗体,为ASFV检测方法的研究提供重要试验材料。【方法】应用大肠杆菌表达重组ASFV p30蛋白,并用该蛋白免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠,应用细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合;通过间接ELISA方法筛选分泌p30蛋白特异性抗体的阳性杂交瘤细胞,腹腔接种小鼠制备腹水抗体;应用ELISA方法鉴定单克隆抗体的类/亚类,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定单克隆抗体与p30-N端(1―105位氨基酸)和p30-C端(100―194位氨基酸)区域的反应活性;针对抗体识别的p30蛋白区域合成不同肽段,通过ELISA和斑点免疫印迹法鉴定抗体识别的抗原表位。应用间接ELISA方法分析单克隆抗体与ASFV p72蛋白、猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳(Cap)蛋白、猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的交叉反应性,以及ASFV抗血清对单克隆抗体抗原结合活性的阻断作用。【结果】获得了2株杂交瘤细胞(C7和G10),其分泌的单克隆抗体(C7和G10)都属于IgG1亚类和κ型(IgG1κ),杂交瘤细胞培养上清和腹水内C7和G10的抗体效价分别为1∶1280、1∶640与1∶10^(7)、1∶10^(6);2株抗体均与p30-C端(100―194位氨基酸)区域特异性结合,并识别同一个抗原表位115 CTSSFETLFEQEPSSEVPKD^(134);2株抗体与ASFV p72蛋白、PCV2 Cap蛋白及PEDV S蛋白无交叉反应;ASFV抗血清能有效阻断2株单克隆抗体与p30蛋白结合。【结论】获得2株分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株,鉴定了单克隆抗体的抗原识别表位,丰富了p30蛋白的抗原表位信息,为ASFV致病机制的进一步研究提供支撑。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白 单克隆抗体 表位

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基于网络药理学探究菟丝子黄酮缓解孕期暴露双酚A致仔鼠生殖损伤的作用机制 被引量：1

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作者 赵千惠 刘莹 +2 位作者 焦玉兰 史万玉 陈福星 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2550-2561,共12页

【目的】分析预测菟丝子黄酮缓解孕期暴露双酚A(bisphenol A,BPA)致仔鼠生殖损伤的潜在活性成分和靶点,探究其可能的作用机制,进而保护动物生殖功能。【方法】通过检索CTD数据库确定BPA潜在靶点,使用TCMSP数据库和TCMIP平台筛选菟丝子... 【目的】分析预测菟丝子黄酮缓解孕期暴露双酚A(bisphenol A,BPA)致仔鼠生殖损伤的潜在活性成分和靶点,探究其可能的作用机制,进而保护动物生殖功能。【方法】通过检索CTD数据库确定BPA潜在靶点,使用TCMSP数据库和TCMIP平台筛选菟丝子黄酮中活性成分和潜在靶点,获得菟丝子黄酮与BPA的共同靶点,利用STRING数据库构建蛋白互作(PPI)网络,使用DAVID数据库进行GO功能和KEGG通路富集分析。应用AutoDock Tools 1.5.7软件将主要活性成分与核心蛋白进行分子对接。在临床试验中用8周龄SPF小鼠制造孕期BPA暴露模型,设置对照组(妊娠1~17 d灌胃玉米油0.2 mL/d)、BPA组(妊娠1~17 d灌胃含5 mg/kg BW BPA的玉米油0.2 mL/d)和菟丝子黄酮组(妊娠1~17 d灌胃含5 mg/kg BW BPA和40 mg/kg BW菟丝子黄酮的玉米油0.2 mL/d)。仔鼠21日龄时测定血清中雌激素(estrogen,E 2)水平及卵巢中E 2受体ESR1和ESR2含量。【结果】菟丝子黄酮中主要活性成分可能为槲皮素、山奈酚和异鼠李素,其与BPA交集的潜在靶点有59个。菟丝子黄酮干预BPA的PPI网络中关联度最高的5个靶点分别为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine-protein kinase,AKT1)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、ESR1、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)和丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)。GO功能富集分析显示,潜在靶点共富集到375个条目,主要涉及磷酸化、细胞对活性氧的反应、膜、细胞质、蛋白质结合、核苷酸结合、转移酶和激酶活性等。KEGG通路富集分析显示,菟丝子黄酮干预BPA损伤过程主要在癌症通路富集,其次在雌激素信号通路、松弛素信号通路、内分泌抵抗等通路富集,这些可能是菟丝子黄酮干预BPA的主要信号通路。此外,该干预过程也与丝氨酸/苏氨酸激酶Akt信号通路(PI3K-Akt)、促性腺激素释放激素信号通路(GnRH)有一定关系。分子对接结果显示,槲皮素、山奈酚、异鼠李素与关键作用靶点AKT1、EGFR、ESR1和MAPK1具有较好结合活性,配体化合物均能稳定地置于受体蛋白的活性对接口袋中。临床试验发现,BPA可极显著降低子代小鼠血清E 2水平(P<0.01),极显著升高ESR1和ESR2含量(P<0.01),扰乱了内分泌稳态,而菟丝子黄酮使激素和受体水平趋于正常。【结论】菟丝子黄酮缓解孕期暴露BPA致仔鼠生殖损伤的作用机制呈多靶点、多系统的特性,除影响机体内分泌相关途径外还可影响癌症通路。 展开更多

关键词 菟丝子黄酮 双酚A(BPA) 网络药理学 分子对接

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新城疫疫苗研究现状 被引量：10

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作者 孟令宅 庞洪泽 +2 位作者 赵卓 赵款 袁万哲 《动物医学进展》 北大核心 2021年第2期107-111,共5页

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的禽类的一种急性烈性传染病,严重危害养禽业的发展。在疫苗接种免疫压力下,NDV演化出不同的基因型,且各基因型毒株之间不能较好地提供交叉保护,导致临床上多见非典型新城疫与高抗体家禽发生NDV感染... 新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的禽类的一种急性烈性传染病,严重危害养禽业的发展。在疫苗接种免疫压力下,NDV演化出不同的基因型,且各基因型毒株之间不能较好地提供交叉保护,导致临床上多见非典型新城疫与高抗体家禽发生NDV感染。目前,疫苗免疫仍是预防该病的重要措施,随着其病原学与分子生物学技术的发展,研究者研发了不同类型的ND疫苗。论文就新城疫病毒的病原分子特征、传统疫苗及新型基因工程疫苗的研究现状及发展前景进行综述,旨在为我国新城疫的防控及新城疫疫苗的研发提供一定的参考。 展开更多

关键词 新城疫病毒 传统疫苗 基因工程疫苗

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