铁蛋白纳米载体及其在生物医学领域的应用潜力 被引量：2

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作者 苏恺 范葶莉 宋勤叶 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期909-919,共11页

铁蛋白是广泛存在于几乎所有生命体中的储铁蛋白,具有储存和转化铁、维持细胞铁代谢平衡以及保护细胞免受氧化损伤等功能。铁蛋白亚基能够自组装成纳米笼,装载和运输各种金属、药物、显影剂等多种物质,并且铁蛋白具有易被修饰以及良好... 铁蛋白是广泛存在于几乎所有生命体中的储铁蛋白,具有储存和转化铁、维持细胞铁代谢平衡以及保护细胞免受氧化损伤等功能。铁蛋白亚基能够自组装成纳米笼,装载和运输各种金属、药物、显影剂等多种物质,并且铁蛋白具有易被修饰以及良好的生物相容性和靶向性等特点,使其成为生物医学领域应用潜力巨大的非病毒天然纳米材料。本文重点综述了铁蛋白的结构和生物学功能,以及基于铁蛋白搭建的纳米载体平台在疾病检测、纳米疫苗和药物载体等领域的研究进展及应用前景,旨在为基于铁蛋白纳米颗粒的相关研究提供参考。 展开更多

关键词 铁蛋白 纳米载体 结构与功能 生物医药 应用潜力

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猪IL-15单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

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作者 王飞燕 刘超凡 +5 位作者 张亚楠 周晓甜 任静 袁晨 李潭清 宋勤叶 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3442-3452,共11页

旨在制备猪白细胞介素-15(IL-15)的单克隆抗体(McAb),建立IL-15-ELISA定量检测方法。首先构建猪IL-15原核表达载体pET-28a-IL-15,应用大肠杆菌原核表达系统表达该重组蛋白,随后用其免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,在加强免疫后第3天,分离小... 旨在制备猪白细胞介素-15(IL-15)的单克隆抗体(McAb),建立IL-15-ELISA定量检测方法。首先构建猪IL-15原核表达载体pET-28a-IL-15,应用大肠杆菌原核表达系统表达该重组蛋白,随后用其免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,在加强免疫后第3天,分离小鼠脾细胞,将脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,并对其分泌的IL-15单克隆抗体进行鉴定;然后基于单克隆抗体建立IL-15夹心ELISA方法。结果显示:获得9株分泌抗IL-15 McAb的杂交瘤细胞(1E8、1F4、2D3、2C10、2F3、2D10、3F4、3D4、3D5),分泌的抗体均为IgG2bκ型。以制备的单抗2D10和2C10分别为捕获抗体及酶标抗体建立的夹心ELISA最低可检测31.25 ng·mL^(-1)的IL-15蛋白,与其它细胞因子或蛋白(IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、Gzms-B、IFN-γ、TNF-α)无交叉反应,批内和批间重复的变异系数分别为2.56%和3.39%。该夹心ELISA可定量检测血清、组织液和细胞培养物等样品中的IL-15。综上,成功制备了猪IL-15单克隆抗体,建立了定量检测IL-15的双抗体夹心ELISA方法,为IL-15相关研究提供了重要工具。 展开更多

关键词 猪IL-15 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA 定量检测

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猪圆环病毒3型阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用

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作者 侯佳璐 任静 +5 位作者 王亚文 袁晨 马天天 杨柳 李清艳 宋勤叶 《中国动物检疫》 2025年第3期91-100,共10页

为建立猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)阻断ELISA抗体检测方法,应用大肠杆菌表达系统表达PCV3衣壳(capsid,Cap)蛋白,制备了2株Cap蛋白单克隆抗体(1D8和3B5),测定了单克隆抗体的解离常数(dissociation constant,KD);选择... 为建立猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)阻断ELISA抗体检测方法,应用大肠杆菌表达系统表达PCV3衣壳(capsid,Cap)蛋白,制备了2株Cap蛋白单克隆抗体(1D8和3B5),测定了单克隆抗体的解离常数(dissociation constant,KD);选择亲和力高的1D8用辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)标记,然后基于Cap蛋白和HRP标记的单克隆抗体1D8建立了PCV3阻断ELISA抗体检测方法。结果显示:当血清阻断率(present inhibition,PI)≥29.3%时,判定PCV3抗体阳性;当血清PI<23.4%时,判定PCV3抗体阴性;当23.4%≤PI<29.3%时,判为可疑。建立的方法与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒等病原抗血清无交叉反应;检测敏感性为1:160,批内和批间重复试验的变异系数分别为0.87%~6.64%和1.03%~9.33%,与Western-blot检测的符合率为95.5%。用建立的阻断ELISA方法检测2021—2024年间从河北省部分猪场采集的205份血清,发现PCV3抗体阳性率为28.8%(59/205),其中仔猪、育肥猪、母猪的抗体阳性率分别为30.0%、32.8%和19.5%。结果表明,本研究建立的PCV3阻断ELISA抗体检测方法可用于PCV3感染的血清学诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。 展开更多

关键词 PCV3 CAP蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA 应用

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鸡源IL-21基因的密码子优化、表达及生物活性分析初探

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作者 朱爱臣 朱凯晴 +3 位作者 孙鹏 张建楼 李妍 霍书英 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期89-95,共7页

本研究旨在对鸡IL-21基因进行克隆、密码子优化、表达分析及生物活性初步研究,为进一步研究其功能奠定基础。首先利用生物信息学软件对鸡IL-21基因进行序列分析,然后,通过RT-PCR扩增鸡的IL-21基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1A-IL-21-wt/... 本研究旨在对鸡IL-21基因进行克隆、密码子优化、表达分析及生物活性初步研究,为进一步研究其功能奠定基础。首先利用生物信息学软件对鸡IL-21基因进行序列分析,然后,通过RT-PCR扩增鸡的IL-21基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1A-IL-21-wt/MH,根据人偏爱密码子对鸡IL-21基因进行密码子优化,构建真核表达质粒pcDNA3.1A-IL-21-opt/MH。测序正确后转染HEK293T细胞进行表达,经His标签纯化后,通过脾脏淋巴细胞增殖实验鉴定纯化后的IL-21蛋白生物活性。结果显示,扩增的鸡IL-21序列与Genbank中的IL-21序列相对比有2个碱基发生突变(141C→141T,312C→312T),但不影响氨基酸序列;生物信息学分析表明,鸡IL-21基因含有信号肽序列可介导其分泌表达,同时含有1个潜在的N-糖基化位点;Western blot在培养基和细胞内均检测到鸡IL-21蛋白的表达;密码子优化后IL-21表达水平与野生型相比显著升高(P<0.0001);MTT法检测发现,纯化后的IL-21具有增强淋巴细胞增殖的功能。综上所述,本试验成功构建了鸡IL-21的真核表达载体,通过密码子优化提高了IL-21在真核细胞中的表达且表达的蛋白具有良好的生物活性,为进一步探索IL-21蛋白功能奠定一定的基础。 展开更多

关键词 IL-21基因 鸡 真核表达 密码子优化 生物活性分析

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3种消毒剂对猪场4种常见细菌的杀菌效果试验 被引量：1

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作者 王文钊 李妍 +7 位作者 代飞 王敬友 顾文源 张帅 赵云环 任晓祥 范京惠 左玉柱 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期139-144,共6页

为了研究聚六亚甲基双胍盐酸盐、过硫酸氢钾复合物、戊二醛-癸甲溴铵在不同作用浓度、不同作用时间对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的灭活效果,为猪场选用消毒剂提供参考。采用悬液定量杀菌试验方法,研究3种消毒剂... 为了研究聚六亚甲基双胍盐酸盐、过硫酸氢钾复合物、戊二醛-癸甲溴铵在不同作用浓度、不同作用时间对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的灭活效果,为猪场选用消毒剂提供参考。采用悬液定量杀菌试验方法,研究3种消毒剂在不同作用浓度、不同作用时间对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的灭活效果。结果显示,以杀菌对数值5.00作为评价标准来判断,聚六亚甲基双胍盐酸盐在500mg/L、5min内对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的杀灭对数值>5.00;过硫酸氢钾复合物在2000mg/L、5min内对大肠埃希氏菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的杀灭对数值>5.00;戊二醛-癸甲溴铵在2000mg/L、10min内对葡萄球菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的杀灭对数值>5.00,大肠埃希氏菌杀灭效果评测试验中,在试验浓度和时间中没有结果显示杀灭对数值5.00。结果表明除了戊二醛-癸甲溴铵对大肠埃希氏菌的杀灭效果相对较差外,3种消毒剂在试验浓度下均具有良好的杀灭细菌繁殖体效果。 展开更多

关键词 聚六亚甲基双胍盐酸盐 过硫酸氢钾复合物 戊二醛-癸甲溴铵 灭菌效果

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非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析 被引量：1

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作者 李艳蕊 任静 +6 位作者 崔锦蔷 袁晨 王云霄 马亚娟 刘志昌 李永社 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1660-1670,共11页

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组... 【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P<0.05)。【结论】本研究表达了ASFV CD2v蛋白胞内域和胞外域,前者的抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) CD2v蛋白 胞外域 胞内域 蛋白表达 抗原性

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昆虫杆状病毒表达的猪圆环病毒2d型Cap蛋白-VLP对仔猪的免疫保护效果

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作者 王亚文 张亚楠 +4 位作者 袁晨 任静 苏恺 杨柳 宋勤叶 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期76-84,共9页

猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组... 猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组装为VLP的PCV2d-Cap蛋白,然后将9头21日龄健康仔猪随机分为VLP组、攻毒对照组和空白对照组(n=3)。VLP组的每头仔猪经颈部肌肉注射400μg Cap蛋白-佐剂复合物(PCV2d-VLP),攻毒组注射等体积的PBS与佐剂混合物,空白组注射等体积的PBS。共接种2次,每次间隔14 d。于第2次免疫后21 d,VLP组和攻毒对照组的仔猪通过鼻腔感染PCV2 HBDX-2018株(106TCID50/头),评价PCV2d-VLP诱导的免疫效果。结果表明PCV2d-VLP能够诱导仔猪产生高水平的特异性IgG抗体和中和抗体,刺激IFN-γ水平升高,引起外周血淋巴细胞增殖能力增强,降低病毒经鼻腔和直肠的排毒率及病毒血症阳性率,减轻腹股沟淋巴结和脾脏的病理损伤,降低组织中的病毒载量。上述研究表明,应用杆状病毒表达的PCV2d-Cap蛋白能自组装为VLP,并能诱导仔猪产生良好的免疫保护效应,具有进一步开发为PCV2d-VLP疫苗的潜力。 展开更多

关键词 PCV2d CAP蛋白 病毒样颗粒 杆状病毒 免疫效果

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非洲猪瘟病毒全长与截短p72蛋白的抗原性比较 被引量：2

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作者 张文燕 王亚文 +6 位作者 冯亚文 滕召剑 李潭清 董炜 刘涛 宋勤叶 任玉红 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期1182-1191,共10页

比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定... 比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定表达的蛋白,分析蛋白的抗原表位;用纯化的重组全长和截短p72蛋白分别免疫小鼠,比较其免疫原性;通过ELISA和Western blot,评价重组p72和p72s蛋白与ASFV阳性血清的免疫反应性。结果:重组p72和p72s蛋白均以包涵体形式表达,相对分子质量分别约为76和42 ku,与预期大小相符;表达蛋白的酶解肽段对p72和p72s蛋白推测氨基酸序列的覆盖度分别为89.3%和88.39%,两者分别包含27和17个抗原表位;用p72与p72s蛋白免疫小鼠3次后,血清特异性抗体效价分别为1∶200~1∶25600和1∶12800~1∶409600;基于重组p72与p72s蛋白的ELISA从108份猪血清中分别检出78份(72.2%)和85份(78.7%)阳性血清,两者的检测结果具有很好的一致性(kappa=0.826,P=0.016);经Western blot检测的10份ASFV抗体阳性血清中有7份与p72蛋白反应,全部与p72s蛋白反应。截短p72蛋白比全长p72蛋白的抗原性好,更适合用于ASFV抗体检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 截短p72蛋白 原核表达 抗原性

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基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：4

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作者 张文燕 王亚文 +5 位作者 袁晨 冯亚文 滕召剑 商佳亮 逯纪成 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第7期2688-2697,共10页

【目的】建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/... 【目的】建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5000;反应条件为:抗原于37℃孵育1 h后经4℃包被酶标板过夜、于37℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为:当待检血清的D_(450 nm)值≥0.365时,判定为阳性;当D_(450 nm)值<0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量(0.110~0.554 mg/mL);批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%(94/124)和32.26%(40/124)。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) 截短p72蛋白 原核表达 间接ELISA

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芪板青颗粒体外抗PRRSV效果研究 被引量：2

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作者 刘斌 张帅 +4 位作者 刘濮毓 赵云环 王荣申 范京惠 左玉柱 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期99-104,F0003,共7页

为了检验芪板青颗粒体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒效果,降低养猪场因感染猪繁殖与呼吸综合征病毒带来的损失,本试验通过调整芪板青颗粒溶液与猪繁殖与呼吸综合征病毒液加到Marc-145细胞中的不同顺序,分别检验芪板青颗粒对猪繁殖与呼吸... 为了检验芪板青颗粒体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒效果,降低养猪场因感染猪繁殖与呼吸综合征病毒带来的损失,本试验通过调整芪板青颗粒溶液与猪繁殖与呼吸综合征病毒液加到Marc-145细胞中的不同顺序,分别检验芪板青颗粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制、杀灭和阻断作用。结果显示:芪板青颗粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒有一定的抑制、杀灭和阻断作用,在芪板青溶液浓度为24.4~3125.0 mg/L时,有显著的抑制和杀灭猪繁殖与呼吸综合征病毒作用,在浓度195.3~3125.0 mg/L时,有显著的阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒作用。结果表明:芪板青颗粒可用于体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒,本试验为芪板青颗粒的应用提供了依据,为猪繁殖与呼吸综合征的防治提供了帮助。 展开更多

关键词 芪板青颗粒 猪繁殖与呼吸综合征 MARC-145细胞

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戊二醛癸甲溴铵弥雾方式对3种病原的消毒试验 被引量：2

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作者 刘濮毓 王文钊 +6 位作者 张帅 李思琪 刘莹 赵云环 王荣申 范京惠 左玉柱 《中国动物检疫》 CAS 2023年第5期115-120,共6页

为探究戊二醛癸甲溴铵弥雾方式对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪链球菌、猪大肠杆菌的临床消毒效果,以实验室条件模拟临床中戊二醛癸甲溴铵弥雾消毒方式,将戊二醛癸甲溴铵和悬浮增效剂以弥雾形式喷雾到所消毒的空间内,对涂布了PRRS... 为探究戊二醛癸甲溴铵弥雾方式对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪链球菌、猪大肠杆菌的临床消毒效果,以实验室条件模拟临床中戊二醛癸甲溴铵弥雾消毒方式,将戊二醛癸甲溴铵和悬浮增效剂以弥雾形式喷雾到所消毒的空间内,对涂布了PRRSV的培养皿和接种猪链球菌、猪大肠杆菌的血清培养基进行消毒,消毒后将培养皿内病毒洗脱后接种于Marc-145细胞,血清培养基放置在适宜环境培养,观察细胞病变和细菌生长情况,以此判断消毒效果。结果显示:戊二醛癸甲溴铵在空间浓度为2.1 mL/m^(3),消毒时间为30 min时,对PRRSV有一定的消毒作用;当空间浓度为3.5 mL/m^(3),消毒时间为60 min时,可对PRRSV完全灭活;空间浓度为2.1 mL/m^(3),消毒时间为50 min时,对猪链球菌可完全灭活,消毒时间为35 min时,对大肠杆菌可完全灭活。结果表明,戊二醛癸甲溴铵弥雾消毒方式对PRRSV、猪链球菌和猪大肠杆菌有着良好的消毒效果,可应用于猪场日常空舍消毒,对猪场生物安全防控具有重要意义。 展开更多

关键词 戊二醛癸甲溴铵 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪链球菌 猪大肠杆菌

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非洲猪瘟病毒可视化重组酶辅助扩增检测方法的建立与初步应用 被引量：4

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作者 岳怀宁 李艳蕊 +6 位作者 张亚楠 苏恺 袁晨 逯纪成 孙泰然 薛文阁 宋勤叶 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第5期19-25,共7页

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)重组酶辅助扩增(RAA)与核酸检测试纸条相结合的可视化RAA检测方法,本试验根据ASFV的B646L基因(编码p72蛋白)保守区设计特异性的引物和探针,通过优化引物和探针浓度、反应温度和反应时间,确定反应的最佳体系... 为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)重组酶辅助扩增(RAA)与核酸检测试纸条相结合的可视化RAA检测方法,本试验根据ASFV的B646L基因(编码p72蛋白)保守区设计特异性的引物和探针,通过优化引物和探针浓度、反应温度和反应时间,确定反应的最佳体系和扩增条件;检测建立的可视化RAA方法的特异性和灵敏性,分析建立方法与非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒对临床样品检测结果的符合率。结果显示,建立的可视化RAA方法的反应体系为25μL,在38℃恒温条件下反应20 min即可在5 min内读取结果;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等均不发生交叉反应;单个反应可检测到48.75拷贝的病毒核酸。初步临床应用结果显示,建立的可视化RAA方法与商品化的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒检测结果一致,其阴性和阳性符合率均为100%。本试验成功建立的基于ASFV B646L基因的可视化恒温扩增方法具有反应时间短、特异性和灵敏度高、操作便捷等优势,适合现场快速检测和诊断,具有进一步开发潜力。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 B646L基因 重组酶辅助扩增技术 可视化 核酸检测试纸条

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猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达及其免疫原性分析 被引量：1

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作者 腾召剑 林依丹 +4 位作者 周双海 李潭清 张义明 宋勤叶 郑士学 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第5期47-51,I0003,共6页

为了表达猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳(Cap)蛋白,分析其免疫原性,本试验构建了不包含Cap蛋白核定位序列的原核表达质粒pET-28a-PCV3-Cap,应用大肠杆菌Escherichia coli表达系统诱导表达了重组Cap蛋白;通过SDS-PAGE、Western Blot及液相色谱... 为了表达猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳(Cap)蛋白,分析其免疫原性,本试验构建了不包含Cap蛋白核定位序列的原核表达质粒pET-28a-PCV3-Cap,应用大肠杆菌Escherichia coli表达系统诱导表达了重组Cap蛋白;通过SDS-PAGE、Western Blot及液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术对表达蛋白进行了鉴定;分析预测了蛋白的抗原表位,并通过动物试验分析蛋白的免疫原性。结果显示,在31℃下经0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h,蛋白(25.4 kDa)表达量最高,其主要以包涵体形式表达;表达蛋白与PCV3参考毒株Cap蛋白氨基酸序列的一致性为88.4%(152/172 aa),并且预测的抗原表位与参考毒株的相符;重组蛋白能够刺激小鼠产生特异性抗体,平均抗体水平≥1∶12800。上述结果表明,表达的蛋白具有良好的免疫原性。该试验为深入解析PCV3-Cap蛋白抗原表位的免疫活性以及相关亚单位疫苗和特异性抗体检测技术的研究提供了科学依据。 展开更多

关键词 PCV3 CAP蛋白 原核表达 抗原表位 免疫原性

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非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：3

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作者 马天天 张亚楠 +8 位作者 冯亚文 岳怀宁 王亚文 苏恺 袁晨 逯纪成 孙泰然 薛文阁 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2832-2842,共11页

【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白单克隆抗体,为ASFV检测方法的研究提供重要试验材料。【方法】应用大肠杆菌表达重组ASFV p30蛋白,并用该蛋白免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠,应用细胞融合技术将免疫小... 【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白单克隆抗体,为ASFV检测方法的研究提供重要试验材料。【方法】应用大肠杆菌表达重组ASFV p30蛋白,并用该蛋白免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠,应用细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合;通过间接ELISA方法筛选分泌p30蛋白特异性抗体的阳性杂交瘤细胞,腹腔接种小鼠制备腹水抗体;应用ELISA方法鉴定单克隆抗体的类/亚类,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定单克隆抗体与p30-N端(1―105位氨基酸)和p30-C端(100―194位氨基酸)区域的反应活性;针对抗体识别的p30蛋白区域合成不同肽段,通过ELISA和斑点免疫印迹法鉴定抗体识别的抗原表位。应用间接ELISA方法分析单克隆抗体与ASFV p72蛋白、猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳(Cap)蛋白、猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的交叉反应性,以及ASFV抗血清对单克隆抗体抗原结合活性的阻断作用。【结果】获得了2株杂交瘤细胞(C7和G10),其分泌的单克隆抗体(C7和G10)都属于IgG1亚类和κ型(IgG1κ),杂交瘤细胞培养上清和腹水内C7和G10的抗体效价分别为1∶1280、1∶640与1∶10^(7)、1∶10^(6);2株抗体均与p30-C端(100―194位氨基酸)区域特异性结合,并识别同一个抗原表位115 CTSSFETLFEQEPSSEVPKD^(134);2株抗体与ASFV p72蛋白、PCV2 Cap蛋白及PEDV S蛋白无交叉反应;ASFV抗血清能有效阻断2株单克隆抗体与p30蛋白结合。【结论】获得2株分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株,鉴定了单克隆抗体的抗原识别表位,丰富了p30蛋白的抗原表位信息,为ASFV致病机制的进一步研究提供支撑。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白 单克隆抗体 表位

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