目的探讨高压力培养下角膜内皮细胞凋亡的启动机制。方法原代兔角膜内皮细胞经免疫组织化学鉴定后,在50mm Hg(1 k Pa=7.5 mm Hg)压力条件下,培养1 h、2 h、24 h,另设正常压力(15 mm Hg)作为正常压力组,培养24 h。第一代兔角膜内皮细胞...目的探讨高压力培养下角膜内皮细胞凋亡的启动机制。方法原代兔角膜内皮细胞经免疫组织化学鉴定后,在50mm Hg(1 k Pa=7.5 mm Hg)压力条件下,培养1 h、2 h、24 h,另设正常压力(15 mm Hg)作为正常压力组,培养24 h。第一代兔角膜内皮细胞融合达70%~80%后,细胞在加压前1 h分别使用浓度均为10^(-6)mol·L^(-1)抗Caspase-8和抗Caspase-9预处理,然后置于压力装置中,压力设定为50 mm Hg,培养24 h后检测蛋白Bcl-2和P53表达,并且以无抑制剂处理的50 mm Hg压力培养的细胞为对照组。各组培养的细胞均经Western blot检测Bcl-2和P53的表达。免疫荧光染色检测兔角膜内皮细胞胞浆细胞色素C的含量。结果 50 mm Hg压力组角膜内皮细胞,加压1 h、2 h、24 h P53的表达量分别为0.651±0.007、0.805±0.006、0.839±0.011,较正常压力组(0.033±0.004)升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);50 mm Hg压力组随着加压时间的延长,角膜内皮细胞中P53蛋白表达量逐渐增加,各时间两两比较,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。50 mm Hg压力组中加压1 h、2 h、24 h Bcl-2的表达量分别为0.590±0.009、0.724±0.005、0.314±0.016,较正常压力组(0.081±0.013)反应性升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);50 mm Hg压力组各时间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.01)。实验发现正常压力组培养24 h后,细胞核呈蓝色,胞浆中无细胞色素C释放;50 mm Hg压力组培养1 h可见部分细胞胞浆呈红色,提示细胞色素C释放进入到胞浆内,随着加压时间延长荧光强度增加,加压24 h见胞浆内出现广泛红色强荧光。抗Caspase-9和抗Caspase-8预处理组的角膜内皮细胞P53表达量分别为0.535±0.007、0.703±0.010,较对照组(0.727±0.021)下调,差异均有统计学意义(均为P<0.01);抗Caspase-9和抗Caspase-8预处理组中Bcl-2的表达量呈抑制性下降,分别为0.312±0.003、0.442±0.011,较对照组(0.501±0.011)下降,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。抗Caspase-9预处理组的角膜内皮细胞P53和Bcl-2表达量较抗Caspase-8预处理组下降,差异亦均有统计学意义(均为P<0.01),表明抗Caspase-9对高压下角膜内皮细胞凋亡的抑制作用更显著。结论Caspase-9抑制剂可有效阻断高压力对角膜内皮细胞的促凋亡作用,高压力对角膜内皮细胞的损伤主要是触发了线粒体细胞色素C的释放,激活了Caspase-9参与的内源性酶联反应性凋亡途径。展开更多
目的观察波动的压力对角膜内皮细胞的影响。方法将体外培养的第一代兔角膜内皮细胞分为两组:A组为压力波动组(压力设置为:15 mm Hg^25 mm Hg^20 mm Hg^10 mm Hg,每个压力持续6 h;1 kPa=7.5 mm Hg);B组为30 mm Hg压力组;C组为无压力组。...目的观察波动的压力对角膜内皮细胞的影响。方法将体外培养的第一代兔角膜内皮细胞分为两组:A组为压力波动组(压力设置为:15 mm Hg^25 mm Hg^20 mm Hg^10 mm Hg,每个压力持续6 h;1 kPa=7.5 mm Hg);B组为30 mm Hg压力组;C组为无压力组。三组细胞分别培养24 h。免疫细胞化学染色法鉴定原代角膜内皮细胞形态;台盼蓝-茜素红联合染色检测细胞活性,HE染色观察细胞形态;Western-blotting检测细胞中Bcl-2和P53蛋白的表达水平。结果获取的所有细胞证实为角膜内皮细胞表型,无角膜上皮细胞及基质细胞污染。三组细胞分别培养24 h后,经台盼蓝-茜素红染色和HE染色证实:两个压力培养组的细胞活性较无压力培养组明显下降,其中压力波动组的细胞活性低于30 mm Hg压力组。同时无压力组、30 mm Hg压力组和压力波动组细胞中P53蛋白的相对表达量分别为0.150±0.005、0.253±0.014、0.670±0.019,差异有统计学意义(P<0.05)。结论证实了高压力及非生理性波动的压力对角膜内皮细胞均具有损伤作用。展开更多
文摘目的探讨高压力培养下角膜内皮细胞凋亡的启动机制。方法原代兔角膜内皮细胞经免疫组织化学鉴定后,在50mm Hg(1 k Pa=7.5 mm Hg)压力条件下,培养1 h、2 h、24 h,另设正常压力(15 mm Hg)作为正常压力组,培养24 h。第一代兔角膜内皮细胞融合达70%~80%后,细胞在加压前1 h分别使用浓度均为10^(-6)mol·L^(-1)抗Caspase-8和抗Caspase-9预处理,然后置于压力装置中,压力设定为50 mm Hg,培养24 h后检测蛋白Bcl-2和P53表达,并且以无抑制剂处理的50 mm Hg压力培养的细胞为对照组。各组培养的细胞均经Western blot检测Bcl-2和P53的表达。免疫荧光染色检测兔角膜内皮细胞胞浆细胞色素C的含量。结果 50 mm Hg压力组角膜内皮细胞,加压1 h、2 h、24 h P53的表达量分别为0.651±0.007、0.805±0.006、0.839±0.011,较正常压力组(0.033±0.004)升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);50 mm Hg压力组随着加压时间的延长,角膜内皮细胞中P53蛋白表达量逐渐增加,各时间两两比较,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。50 mm Hg压力组中加压1 h、2 h、24 h Bcl-2的表达量分别为0.590±0.009、0.724±0.005、0.314±0.016,较正常压力组(0.081±0.013)反应性升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);50 mm Hg压力组各时间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.01)。实验发现正常压力组培养24 h后,细胞核呈蓝色,胞浆中无细胞色素C释放;50 mm Hg压力组培养1 h可见部分细胞胞浆呈红色,提示细胞色素C释放进入到胞浆内,随着加压时间延长荧光强度增加,加压24 h见胞浆内出现广泛红色强荧光。抗Caspase-9和抗Caspase-8预处理组的角膜内皮细胞P53表达量分别为0.535±0.007、0.703±0.010,较对照组(0.727±0.021)下调,差异均有统计学意义(均为P<0.01);抗Caspase-9和抗Caspase-8预处理组中Bcl-2的表达量呈抑制性下降,分别为0.312±0.003、0.442±0.011,较对照组(0.501±0.011)下降,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。抗Caspase-9预处理组的角膜内皮细胞P53和Bcl-2表达量较抗Caspase-8预处理组下降,差异亦均有统计学意义(均为P<0.01),表明抗Caspase-9对高压下角膜内皮细胞凋亡的抑制作用更显著。结论Caspase-9抑制剂可有效阻断高压力对角膜内皮细胞的促凋亡作用,高压力对角膜内皮细胞的损伤主要是触发了线粒体细胞色素C的释放,激活了Caspase-9参与的内源性酶联反应性凋亡途径。
文摘目的观察波动的压力对角膜内皮细胞的影响。方法将体外培养的第一代兔角膜内皮细胞分为两组:A组为压力波动组(压力设置为:15 mm Hg^25 mm Hg^20 mm Hg^10 mm Hg,每个压力持续6 h;1 kPa=7.5 mm Hg);B组为30 mm Hg压力组;C组为无压力组。三组细胞分别培养24 h。免疫细胞化学染色法鉴定原代角膜内皮细胞形态;台盼蓝-茜素红联合染色检测细胞活性,HE染色观察细胞形态;Western-blotting检测细胞中Bcl-2和P53蛋白的表达水平。结果获取的所有细胞证实为角膜内皮细胞表型,无角膜上皮细胞及基质细胞污染。三组细胞分别培养24 h后,经台盼蓝-茜素红染色和HE染色证实:两个压力培养组的细胞活性较无压力培养组明显下降,其中压力波动组的细胞活性低于30 mm Hg压力组。同时无压力组、30 mm Hg压力组和压力波动组细胞中P53蛋白的相对表达量分别为0.150±0.005、0.253±0.014、0.670±0.019,差异有统计学意义(P<0.05)。结论证实了高压力及非生理性波动的压力对角膜内皮细胞均具有损伤作用。
