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动物源化改型单链抗体的设计、表达及杀虫活性
1
作者 仲建锋 高美静 +1 位作者 卢莉娜 张志勇 《农药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1069-1079,共11页
抗独特型抗体制备技术是开发新型抗虫蛋白资源的一项创新策略。为设计构造以基因工程抗体为基础的杀虫蛋白资源,制备了对小菜蛾(Plutella xylostella)具有杀虫活性的猪、牛源改型单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)。通过N... 抗独特型抗体制备技术是开发新型抗虫蛋白资源的一项创新策略。为设计构造以基因工程抗体为基础的杀虫蛋白资源,制备了对小菜蛾(Plutella xylostella)具有杀虫活性的猪、牛源改型单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)。通过NCBI数据库搜索猪、牛源抗体重、轻链可变区的8个骨架区,在其中植入人源抗独特型sc Fv 3E1的6个互补决定区,并进行人工合成及替换成噬菌体展示表达载体p IT2;利用间接竞争ELISA对动物源化改型sc Fv进行分型鉴定;利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术分析动物源化改型sc Fv与小菜蛾刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMV)的结合能力;采用浸叶法测定动物源化改型sc Fv对小菜蛾的生物活性。通过替换表达载体获得了猪源swine-3E1-p IT2质粒和牛源bovine-3E1-p IT2质粒,结果显示:swine-p IT2和bovine-p IT2表达上清液对Cry1B与其多克隆抗体(p Ab)结合的抑制率分别为44.3%和43.0%,模拟抗原Cry1B的某些结构功能,发现两者均属于β型抗独特型sc Fv。SPR分析发现,swine-p IT2、bovine-p IT2与小菜蛾BBMV的结合能力分别为209.48和195.31 RU。生物活性测定结果显示,改造后的swinep IT2和bovine-p IT2对小菜蛾幼虫均具有杀虫活性,LD_(50)值分别为5.90×10^(7)和6.22×10^(7)CFU/m L,均低于亲本3E1的6.86×10^(7)CFU/m L;并且改造后2种材料的毒力回归方程的斜率分别为1.50和1.48,均高于3E1(1.23)。综上,动物源化swine-p IT2和bovine-p IT2改型sc Fv属β型抗独特型sc Fv,能够与小菜蛾的BBMV结合,且具有杀虫活性,为新型生物农药蛋白资源挖掘提供了新的思路。 展开更多
关键词 动物源化 BT毒素 改型抗体 杀虫活性 表面等离子共振 小菜蛾
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饲料中玉米赤霉烯酮的提纯与测定 被引量：3
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作者 王宏杰 徐剑宏 +3 位作者 祭芳 丁衬衬 董飞 史建荣 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第3期663-667,共5页
玉米赤霉烯酮污染饲料对人、畜造成巨大威胁,因此,对饲料中玉米赤霉烯酮检测水平的提高已不容忽视。为玉米赤霉烯酮监控提供灵敏、可靠的分析方法和试验数据,对其提纯与高效液相色谱测定方法进行了研究,结果表明：样品纯化条件,以二氯... 玉米赤霉烯酮污染饲料对人、畜造成巨大威胁,因此,对饲料中玉米赤霉烯酮检测水平的提高已不容忽视。为玉米赤霉烯酮监控提供灵敏、可靠的分析方法和试验数据,对其提纯与高效液相色谱测定方法进行了研究,结果表明：样品纯化条件,以二氯甲烷和NaCl溶液为提取剂,湿填硅胶柱为富集净化柱,用6 ml的甲醇溶液洗脱,采用HPLC进行测定;高效液相色谱检测条件,流动相为甲醇/水（80∶20,体积比）,流速为0.6 ml/min,紫外检测波长为236 nm,此时最低检出限为5μg/kg,在1.25~40.00μg/ml范围内,被测物浓度与测定的峰面积呈线性关系（r=0.999 1）;通过对检测方法日内、日间加标回收试验得到该检测方法回收率约为96.3%。该方法简便、快速、准确,可适用于饲料中玉米赤霉烯酮的提纯与测定。 展开更多
关键词 玉米赤霉烯酮 纯化 检测 高效液相色谱
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伪狂犬病毒感染对BHK-21悬浮细胞内质网应激和未折叠蛋白反应的影响
3
作者 陈丽 倪敏舒 +4 位作者 徐悦 鲍熹 庄腾寒 冯磊 郭美锦 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第8期3235-3244,共10页
【目的】探讨伪狂犬病毒(PRV)感染对BHK-21悬浮细胞内质网应激及未折叠蛋白反应(UPR)的影响。【方法】将悬浮的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)以感染复数(MOI)0.01接种PRV,分别在接毒后12、24、36、48和56 h取样,用CCK-8法检测细胞存活率,按Reed-... 【目的】探讨伪狂犬病毒(PRV)感染对BHK-21悬浮细胞内质网应激及未折叠蛋白反应(UPR)的影响。【方法】将悬浮的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)以感染复数(MOI)0.01接种PRV,分别在接毒后12、24、36、48和56 h取样,用CCK-8法检测细胞存活率,按Reed-Muench法检测病毒滴度,筛选病毒接种处理的合适时间;以不接毒细胞作对照组,分别在感染后12、24、36和48 h取样,用实时荧光定量PCR法检测内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及UPR的3种感受蛋白(PERK、IRE1、ATF6)相关通路中基因的表达变化,Western blotting法检测相关蛋白的表达变化。在接种PRV同时分别加入0、0.001、0.005、0.01和0.02μmol/L内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(Tg)和0、20、40、80和160μmol/L内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸(TUDCA),48 h收集细胞测定病毒滴度和细胞存活率。【结果】PRV感染56 h细胞存活率低于70%,感染48 h时病毒滴度达到最高(8.1 lg TCID/mL),因此后续试验分别在接毒后12、24、36和48 h取样。与对照组相比,PRV感染36和48 h GRP78转录水平均极显著升高(P<0.01);PERK通路中,转录激活因子4(ATF4)转录水平在PRV感染36、48 h均极显著升高(P<0.01),生长抑制DNA损伤基因34(GADD34)转录水平在PRV感染36 h显著升高(P<0.05)、48 h极显著升高(P<0.01),磷酸化真核翻译起始因子(P-eIF2α)蛋白水平在PRV感染36、48 h均极显著升高(P<0.01);IRE1通路中,PRV感染组细胞36 h后多以剪切形式sXBP1存在,同时下游p58mRNA水平在36 h显著增加(P<0.05),p58和EDEM mRNA水平在48 h均极显著增加(P<0.01);ATF6通路中,PRV感染不同时间ERp57、PDI、Calnexin和Calreticulin的表达均无显著变化(P>0.05)。与0μmol/L组相比,0.01和0.02μmol/L Tg极显著降低细胞存活率(P<0.01),0.005和0.01μmol/L Tg均极显著增加了PRV病毒滴度(P<0.01)。【结论】PRV感染可以诱导BHK-21悬浮细胞内质网应激,激活UPR的PERK和IRE1信号通路,说明PRV利用内质网应激增强其复制。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 BHK-21悬浮细胞 内质网应激 未折叠蛋白反应
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近红外高光谱成像结合特征波长筛选识别小麦赤霉病瘪粒 被引量：15
4
作者 沈广辉 曹瑶瑶 +3 位作者 刘馨 徐剑宏 史建荣 LEE Yin-won 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2021年第2期509-516,共8页
为实现小麦赤霉病瘪粒快速识别,本研究使用主成分分析(Principal component analysis,PCA)结合最大类间方差法(Otsu)对小麦高光谱图像进行背景分割,以赤霉病瘪粒识别正确率为评价指标,探究判别分析方法与竞争性自适应权重取样法(Competi... 为实现小麦赤霉病瘪粒快速识别,本研究使用主成分分析(Principal component analysis,PCA)结合最大类间方差法(Otsu)对小麦高光谱图像进行背景分割,以赤霉病瘪粒识别正确率为评价指标,探究判别分析方法与竞争性自适应权重取样法(Competitive adaptive reweighted sampling,CARS)的最佳组合方式。结果显示,基于全谱段构建的偏最小二乘判别分析(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和支持向量机判别分析(Support vector machine discriminant analysis,SVM-DA)模型预测精度相同,外部验证集健康籽粒和赤霉病瘪粒识别正确率分别为95.2%和100.0%;基于CARS筛选的8个特征波长构建的CARS-PLS-DA模型外部验证集健康籽粒和赤霉病瘪粒识别正确率均为100.0%,预测精度高于CARS-SVM-DA模型,可有效实现赤霉病瘪粒的快速识别。研究结果将为谷物仓储和加工过程中赤霉病瘪粒高通量快速识别提供理论依据和技术支撑。 展开更多
关键词 高光谱成像 赤霉病瘪粒 近红外光谱 无损检测
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腐霉利和咯菌腈混用对黄瓜灰霉病菌的联合毒力及药剂残留动态 被引量：8
5
作者 张江兆 徐重新 +4 位作者 沈燕 高美静 卢莉娜 卢飞 刘贤金 《农药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期851-858,共8页
为探究腐霉利和咯菌腈混用对黄瓜灰霉病病原菌灰葡萄孢的联合毒力,进而通过减少用药量及施药后残留动态分析,提升黄瓜中这两种农药的风险防控水平。采用菌丝生长速率法,测得腐霉利和咯菌腈对灰霉病菌菌丝生长的有效抑制中浓度(EC50)分别... 为探究腐霉利和咯菌腈混用对黄瓜灰霉病病原菌灰葡萄孢的联合毒力,进而通过减少用药量及施药后残留动态分析,提升黄瓜中这两种农药的风险防控水平。采用菌丝生长速率法,测得腐霉利和咯菌腈对灰霉病菌菌丝生长的有效抑制中浓度(EC50)分别为0.069 mg/L和0.103 mg/L;而将两种农药以质量比1∶1混用时,EC_(50)值为0.016 mg/L,增效系数(synergistic ratio,SR)达到5.0,表现为强增效作用。腐霉利和咯菌腈单独处理3 d后的灰霉病菌菌丝经电镜扫描观察,分别表现为菌丝干瘪和胞内物质溢出;而经两种农药以质量比1∶1混合处理后,灰霉病菌同时出现了菌丝干瘪和胞内物质溢出现象,混用对菌丝的损伤符合叠加增强特征。为进一步分析腐霉利和咯菌腈混配施用后的动态残留情况,对可同时检测这两种农药残留的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)方法进行了优化。所用方法下,腐霉利和咯菌腈的添加回收率分别为100%~102%和94%~96%,相对标准偏差(R S D)为1.7%~5.3%和2.8%~3.4%,定量限(LOQ)为0.01 mg/kg,符合残留检测要求。两种农药以质量比1∶1混配用于田间试验,施药21 d后在黄瓜上的最终残留量比单独使用腐霉利和咯菌腈分别降低了59%和86%;混配施药后腐霉利和咯菌腈的消解半衰期分别从5.38 d和6.93 d缩短至4.39 d和4.33 d。研究表明,腐霉利和咯菌腈混用切实增强了对黄瓜灰霉病菌的联合毒力,为农药合理减量增效应用提供了依据,同时还可有效降低黄瓜中的农药残留风险。 展开更多
关键词 腐霉利 咯菌腈 黄瓜灰霉病 灰葡萄孢 混配 联合毒力 增效作用 残留分析
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油助剂和淀粉源助剂对噻嗪酮和烯啶虫胺在水稻上残留的影响 被引量：7
6
作者 沈燕 朱宏 +2 位作者 余向阳 刘贤金 张志勇 《农药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期370-377,共8页
为探究油助剂和淀粉源助剂对噻嗪酮和烯啶虫胺降解规律的影响,以水稻为试材,建立了噻嗪酮和烯啶虫胺在水稻不同部位残留的高效液相色谱-三重四极杆串联质谱测定方法,并采用该方法研究了两种农药在水稻不同部位的残留量变化和最终残留量... 为探究油助剂和淀粉源助剂对噻嗪酮和烯啶虫胺降解规律的影响,以水稻为试材,建立了噻嗪酮和烯啶虫胺在水稻不同部位残留的高效液相色谱-三重四极杆串联质谱测定方法,并采用该方法研究了两种农药在水稻不同部位的残留量变化和最终残留量。结果表明:在0.01(0.02)~0.5 mg/kg添加水平下,噻嗪酮在水稻穗部、植株、籽粒和稻壳中的平均回收率在89%~100%之间,相对标准偏差(RSD)为2.5%~7.2%;烯啶虫胺在水稻穗部、植株、籽粒和稻壳中的平均回收率在88%~99%之间,RSD为2.5%~13%。两种农药的定量限均为0.01~0.02 mg/kg。以70%烯啶·噻嗪酮水分散粒剂为供试药剂的残留消解动态试验结果表明,噻嗪酮和烯啶虫胺的残留量与施药后的间隔时间呈指数关系,消解动态符合一级反应动力学方程。在未添加助剂和添加淀粉源助剂及油助剂的3个处理中,噻嗪酮在水稻穗部的原始沉积量由大到小的顺序为:添加油助剂>添加淀粉源助剂>未添加助剂;半衰期长短顺序为:添加油助剂>添加淀粉源助剂>未添加助剂。至水稻收获时,在水稻籽粒和稻壳中均未检出噻嗪酮和烯啶虫胺,在水稻植株中噻嗪酮和烯啶虫胺的残留量均为<0.02~0.05 mg/kg。田间试验结果显示:施用70%烯啶·噻嗪酮水分散粒剂后14 d,添加油助剂或淀粉源助剂的处理对稻田灰飞虱Laodelphax striatellus的防治效果显著高于未添加助剂的。研究结果表明,添加助剂能不同程度地延长农药有效成分在水稻上的持留时间,从而有利于农药药效的持续发挥,而其最终残留量并不高,表明添加助剂在增加农药药效的同时,其残留的农药并不会对农产品造成污染。在供试的两种助剂中油助剂的增效效果好于淀粉源助剂。 展开更多
关键词 油助剂 淀粉源助剂 噻嗪酮 烯啶虫胺 水稻 农药残留 减施增效
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