mfat-1转基因小鼠通过促进神经干细胞增殖修复缺氧缺血性脑损伤

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作者 刘雨桐 张何 +3 位作者 蔡皓然 陈雨沐 杨海元 王盈 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第11期1483-1490,共8页

目的:验证mfat-1转基因小鼠是否通过促进成体神经干细胞增殖修复缺氧缺血性脑损伤。方法:在体外实验中,分离并培养mfat-1转基因小鼠和同窝阴性鼠的成体神经干细胞,进行氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)造... 目的:验证mfat-1转基因小鼠是否通过促进成体神经干细胞增殖修复缺氧缺血性脑损伤。方法:在体外实验中,分离并培养mfat-1转基因小鼠和同窝阴性鼠的成体神经干细胞,进行氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)造模,检测神经干细胞增殖情况;在体内实验中,对mfat-1转基因小鼠及其同窝阴性对照小鼠进行缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)造模,检测成体神经干细胞的增殖能力。结果:成功构建HIBD小鼠模型和神经干细胞体外培养体系。mfat-1转基因小鼠来源的成体神经干细胞的增殖能力较野生型小鼠来源的成体神经干细胞更强;与野生型小鼠比较,mfat-1转基因小鼠神经干细胞增殖能力显著增强且行为学改善。结论:mfat-1转基因小鼠通过促进神经干细胞增殖修复小鼠HIBD。 展开更多

关键词 mfat-1 成体神经干细胞 缺氧缺血性脑损伤 增殖

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n-3多不饱和脂肪酸对NOD小鼠T细胞的免疫调节作用 被引量：6

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作者 李琳 李晓曦 +2 位作者 毕欣芸 刘珊珊 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1707-1711,共5页

目的:探讨n-3多不饱和脂肪酸(n-3 poly unsaturated fatty acid,n-3 PUFA)对NOD小鼠T细胞免疫学功能的影响。方法:取野生型Balb/c小鼠和已出现典型的Ⅰ型糖尿病症状的NOD小鼠脾脏细胞,磁珠分选后获得小鼠CD4^+T细胞,将其分为4组:野生型... 目的:探讨n-3多不饱和脂肪酸(n-3 poly unsaturated fatty acid,n-3 PUFA)对NOD小鼠T细胞免疫学功能的影响。方法:取野生型Balb/c小鼠和已出现典型的Ⅰ型糖尿病症状的NOD小鼠脾脏细胞,磁珠分选后获得小鼠CD4^+T细胞,将其分为4组:野生型小鼠为Wild type组;NOD小鼠分为未处理组、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)处理组、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)处理组。DHA、EPA处理24 h,PMA和Ionomycin刺激活化后,采用CCK-8法检测T细胞增殖、流式细胞仪检测Th1/Th2极化、ELISA法检测T细胞细胞因子的分泌水平变化。结果:DHA、EPA对T细胞增殖具有显著抑制作用,促进NOD小鼠Th2细胞分化,抑制Th1细胞分化,经ELISA检测,DHA和EPA能够抑制T细胞IL-6、IL-17的分泌。结论:n-3多不饱和脂肪酸通过抑制T细胞增殖,平衡Th1/Th2比例和抑制IL-6、IL-17的分泌,对NOD小鼠的T淋巴细胞起到免疫抑制作用。 展开更多

关键词 N-3多不饱和脂肪酸 T细胞 NOD小鼠

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人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立 被引量：1

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作者 王蒙 朱晓晗 +4 位作者 刘晓蕊 李琳 王盈 杨海元 戴一凡 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2022年第4期505-509,共5页

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶... 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPING1-/-猪模型的构建提供了必需的实验材料。 展开更多

关键词 SERPING1 CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞

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GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

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作者 张敏 姚俊 +6 位作者 鲁雅洁 王红顺 王盈 杨海元 魏钦俊 曹新 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期4-10,共7页

目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪... 目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法:采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以p X330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果:生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论:人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。 展开更多

关键词 GPRASP2 CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞 GPRASP2基因敲除细胞系

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整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立

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作者 张曼玲 陈袁 +6 位作者 赵丽华 李艳如 金永 王俊政 姜海滨 陈俏羽 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2017年第11期1377-1384,共8页

目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝... 目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的相关研究奠定基础。方法:以PEF细胞c DNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段(RLD),最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体p TRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果:扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1(975bp)、LIN28(727bp)和DPPA5(408bp),并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,最终构建了3个表达载体(p TRE3G-Zs-OCT4、p TRE3G-Zs-TBX3、p TRE3G-Zs-RLD),且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与p EF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论:成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。 展开更多

关键词 猪转录因子 2A肽基因序列 诱导表达载体 转基因细胞系 IPS细胞

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GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立 被引量：6

6

作者 李楚 任雪洋 +11 位作者 李琳 厉小雪 金永 张曼玲 刘晓蕊 熊强 张立宁 王盈 李荣凤 杨海元 冯书堂 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期835-840,共6页

目的:利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法:设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染... 目的:利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法:设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中αGal和Sd(a)抗原的表达。结果:成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其PBMC无αGal和Sd(a)抗原的表达。结论:CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。 展开更多

关键词 近交系五指山小型猪 GGTA1/β4GalNT2 CRISPR/Cas9 异种移植

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胎猪肾脏发育不同时期相关信号分子的表达 被引量：4

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作者 刘曼菱 赵丽华 +5 位作者 张曼玲 金永 王晨宇 尤志欢 张红 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期822-828,共7页

目的:明确不同时期胎猪的肾脏发育情况,并研究胎猪肾脏发育相关信号分子的表达。方法:收集不同时期(妊娠21.5、27.5、35.0、45.0、75.0及110.0 d)胎猪肾脏组织,应用HE法观察不同时期胎猪肾脏的组织结构。通过实时荧光定量PCR和Western b... 目的:明确不同时期胎猪的肾脏发育情况,并研究胎猪肾脏发育相关信号分子的表达。方法:收集不同时期(妊娠21.5、27.5、35.0、45.0、75.0及110.0 d)胎猪肾脏组织,应用HE法观察不同时期胎猪肾脏的组织结构。通过实时荧光定量PCR和Western blot分别检测肾脏发育相关信号分子(Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4)的mRNA和蛋白表达水平,并通过免疫组织化学检测Pax2在不同时期胎猪肾脏的表达定位情况。结果:27.5 d胎猪的后肾已经开始发育;35 d早期肾小体已经出现,肾小管也开始发育;45 d观察到近皮质不成熟的肾小体和近髓质成熟的肾小体;75 d肾单位数目显著增加,观察到肾椎体、肾乳头和肾盂;110d肾脏基本发育成熟,皮髓质分界明显,仍有新的肾单位产生。Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4在胎猪75d的肾脏中mRNA和蛋白表达量高于35 d。Pax2广泛表达于输尿管芽、后肾间充质、帽状间充质、肾小囊体、逗号形体、S形体以及肾小管,并在后肾发育过程中持续表达。结论:27.5 d时胎猪后肾已经开始发育,110 d基本发育成熟。Pax2、Pax8、Six2、Six1、Sall1和Bmp4等信号分子在胎猪肾脏发育过程中均有不同程度表达,其中Pax2可能是胎猪肾脏发育的关键调控分子。 展开更多

关键词 肾脏发育 PAX2 猪

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人/猪OSBPL2同源性比较及猪PFFs靶基因敲除细胞系的建立 被引量：8

8

作者 曾华沙 姚俊 +4 位作者 王红顺 王盈 杨海元 曹新 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期149-154,共6页

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法:首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析... 目的:基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法:首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),以p X330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型。结果:生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88%,且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sg RNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论:人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sg RNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。 展开更多

关键词 OSBPL2 共线性分析 CRISPR/Cas9 PFFs

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利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系 被引量：2

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作者 朱晓晗 刘晓蕊 +3 位作者 李琳 王盈 杨海元 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期1-7,共7页

目的:利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法:首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人... 目的:利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法:首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)设计并合成单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果:生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论:人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体可以高效编辑PFF中的F9基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。 展开更多

关键词 血友病乙 F9 CRISPR/Cas9 FⅨ

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成年小鼠神经干细胞培养、鉴定以及多不饱和脂肪酸含量的测定 被引量：2

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作者 张正卫 俞俊峰 +6 位作者 王荣根 阮苗苗 张润洁 方斌 王冠 王盈 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2017年第4期394-398,共5页

目的 :探讨成年小鼠大脑室下区神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外分离培养和鉴定的方法 ,测定体外培养的神经干细胞多不饱和脂肪酸n6/n3的比例和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)含量。方法:取8~10周龄的C57BL/6小鼠室... 目的 :探讨成年小鼠大脑室下区神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外分离培养和鉴定的方法 ,测定体外培养的神经干细胞多不饱和脂肪酸n6/n3的比例和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)含量。方法:取8~10周龄的C57BL/6小鼠室下区细胞,进行体外悬浮培养,观察NSCs形成情况,免疫荧光鉴定NSCs干细胞特性及体外分化能力,气相色谱鉴定NSCs的多不饱和脂肪酸含量中n6/n3比例及DHA含量。结果:体外培养的细胞可以增殖,并可以连续传代;免疫荧光显示神经干细胞呈抗巢蛋白阳性,神经干细胞在分化培养基培养时可分化为NeuN、TuJ1、GFAP、O4阳性细胞;神经干细胞的多不饱和脂肪酸含量较鼠尾高。结论:采用无血清培养基成功获得成年小鼠室下区的神经干细胞,具有增殖、自我更新和分化的能力;神经干细胞的n3多不饱和脂肪酸含量明显高于鼠尾中的含量,且DHA多不饱和脂肪酸占较高比例。 展开更多

关键词 神经干细胞 神经球 脑室下区 多不饱和脂肪酸

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建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系 被引量：1

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作者 陈袁 赵丽华 +7 位作者 杨宁 张曼玲 金永 侯道荣 吴兆强 李艳如 姜海滨 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期897-904,共8页

目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(i PS细胞)。方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体p CAG-p LIF转染至小鼠ST... 目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(i PS细胞)。方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体p CAG-p LIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-p LIF细胞)。通过RT-PCR、q PCR、Western blot等方法检测STO-p LIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-p LIF细胞作为饲养层,培养大鼠i PS细胞。通过生长曲线检测、碱性磷酸酶染色、干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-p LIF细胞饲养层在大鼠i PS细胞培养方面的功能。结果:STO-p LIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P<0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠i PS细胞在形态、多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠i PS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠i PS存在差异(P<0.05)。结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-p LIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠i PS细胞培养中具有一定优势。 展开更多

关键词 猪白血病抑制因子 小鼠STO细胞 饲养层细胞 大鼠i PS细胞

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CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立 被引量：1

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作者 王俊政 李艳如 +7 位作者 赵丽华 刘曼菱 张曼玲 金永 陈俏羽 王晨宇 尤志欢 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期143-148,共6页

目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模... 目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。 展开更多

关键词 猪 CRISPR/Cas9 Six1基因敲除细胞系 Six1/Six4基因敲除细胞系

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OSBPL2基因缺陷型巴马小型猪肥胖相关特征的分析 被引量：1

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作者 王天明 曾华沙 +6 位作者 王盈 杨海元 姚俊 鲁雅洁 魏钦俊 曹新 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1281-1288,共8页

目的:分析氧化固醇结合样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)基因缺陷型巴马小型猪肥胖相关的表型特征和可能机制。方法:将3月龄野生型(wild type,WT)和OSBPL2缺陷型(mutant type,MT)巴马小型猪饲喂高脂饲料(high fat diet... 目的:分析氧化固醇结合样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)基因缺陷型巴马小型猪肥胖相关的表型特征和可能机制。方法:将3月龄野生型(wild type,WT)和OSBPL2缺陷型(mutant type,MT)巴马小型猪饲喂高脂饲料(high fat diet,HFD)。喂食9个月后检测体重、皮下脂肪厚度,HE染色观察肝脏脂肪变性,电镜观察肝脏组织亚细胞结构,检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶等生化指标,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测肝脏脂肪合成分化相关基因的变化,Western blot及免疫组织化学法检测脂肪酸结合蛋白4(adipocyte fatty acid binding protein 4,FABP4)及酰基辅酶A氧化酶1(acylcoenzyme A oxidase 1,ACOX1)蛋白表达水平。结果:MT-HFD组体重、皮下脂肪厚度明显高于WT-HFD组(P<0.05);HE染色结果显示,MT-HFD组脂肪细胞显著增大(P<0.001);MT-HFD组肝脏脂肪空泡变性明显多于WT-HFD组。qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学染色结果发现,MT-HFD组肝组织中FABP4蛋白含量明显增加,ACOX1蛋白明显减少;电镜结果显示MT-HFD组肝脏线粒体相关内质网膜长度变短。结论:OSBPL2缺陷引起巴马小型猪肥胖相关表型特征,可能与抑制脂肪酸β-氧化、影响能量代谢平衡及促进脂肪分化有关。 展开更多

关键词 氧化固醇结合蛋白样蛋白2 基因敲除 巴马小型猪模型 肥胖

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稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立 被引量：1

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作者 胡菲菲 张纬 +6 位作者 欧阳琦 王荣根 李泽 王冠 王盈 杨海元 戴一凡 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期868-873,共6页

目的 :建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)系。方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体p EF1α-Ds Red-Express2导入h ESCs中。利用碱性磷酸酶染色、RT-PCR、... 目的 :建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)系。方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体p EF1α-Ds Red-Express2导入h ESCs中。利用碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后h ESCs的干细胞特性。结果:核转染后h ESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性。核转染前后h ESCs的Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达未出现明显差异。RFP-h ESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上。结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的h ESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究。 展开更多

关键词 人胚胎干细胞 核转染 红色荧光蛋白 类胚体

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miRNA-205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能干细胞建系的作用 被引量：1

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作者 陈俏羽 赵丽华 +8 位作者 陈袁 张曼玲 侯道荣 姜海滨 王俊政 刘曼菱 王晨宇 尤志欢 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期713-720,共8页

目的:构建miRNA-205过表达载体并研究miRNA-205对猪诱导多能干细胞系建立的影响。方法:对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪内细胞团细胞及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行miRNA表达谱的分析比较,利用PCR扩增miRNA-205前体序列,并... 目的:构建miRNA-205过表达载体并研究miRNA-205对猪诱导多能干细胞系建立的影响。方法:对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪内细胞团细胞及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行miRNA表达谱的分析比较,利用PCR扩增miRNA-205前体序列,并将其克隆于基础表达载体p CAGDNA3-h Fat1,构建过表达载体p CAG-miR205。使用脂质体转染技术将该载体转染到已转基因修饰的猪胎儿成纤维细胞(含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)。利用干细胞培养液诱导培养建立猪诱导性多能干细胞系。通过实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miRNA-205的表达情况,比较分析miRNA-205对猪诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果:成功构建了p CAG-miR205过表达载体;相较于未转染细胞,转染该载体细胞的miRNA-205表达量显著升高(P<0.01);利用干细胞培养液诱导后培养转染组的诱导性多能干细胞克隆长出率高于未转染细胞组。结论:研究结果表明在细胞水平上过表达micro RNA-205,可提高猪诱导性多能干细胞建系效率;已构建的miRNA-205过表达载体将有助于在后续研究中建立稳定表达miRNA-205的细胞系,为进一步深入研究miRNA-205在干细胞重编程和多能性维持中的作用机制打下基础。 展开更多

关键词 猪 miRNA-205 诱导多能干细胞

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利用CRISPR/Cas9建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系 被引量：1

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作者 胡廷栋 王蒙 +3 位作者 刘晓蕊 杨海元 戴一凡 王盈 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期483-488,521,共7页

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞(neural stem cell,NSC)PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法:取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA(single guide RNA... 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞(neural stem cell,NSC)PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法:取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体神经干细胞,通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞;利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平,免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白(Nestin)的表达,Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果:成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达,免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性,神经干细胞分化培养时可部分分化为BetaⅢTubulin阳性的神经元细胞。结论:CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达,初步表型分析显示,神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin,并具有向神经元分化的能力。 展开更多

关键词 成体神经干细胞 CRISPR/Cas9 PIN1

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猪naive-like诱导性多能干细胞系的建立及红色荧光蛋白标记 被引量：1

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作者 姜海滨 张曼玲 +5 位作者 赵丽华 金永 陈袁 王俊政 陈俏羽 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2017年第8期915-925,共11页

目的 :建立猪naive-like诱导性多能干(induced pluripotent stem,i PS)细胞系,并对其进行红色荧光标记,为通过示踪猪naive i PS细胞发育和分化的相关研究奠定基础。方法:首先利用核转染技术向巴马小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryoni... 目的 :建立猪naive-like诱导性多能干(induced pluripotent stem,i PS)细胞系,并对其进行红色荧光标记,为通过示踪猪naive i PS细胞发育和分化的相关研究奠定基础。方法:首先利用核转染技术向巴马小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)中转入鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子表达载体Tet O-FUW-OSKM,并同时转入激活表达载体FUW-M2rt TA,采用白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)的培养体系进行培养,通过在培养液中添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)进行诱导,建立起猪i PS细胞系,并对细胞系的多能性进行鉴定。在此基础上,向i PS细胞系转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行标记,并鉴定被红色荧光标记后的细胞是否仍然具有多能性。结果:所建立的i PS细胞系克隆呈三维立体生长,可以进行单细胞传代培养至30代以上,核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达多种干细胞多能因子,利用LIF/STAT3信号通路维持其增殖,体外可分化形成表达三胚层相关基因的类胚体,为猪naive-like i PS细胞系。成功对所建立的i PS细胞系进行红色荧光标记,碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色结果显示被红色荧光标记的i PS细胞的多能性依然存在。结论:成功建立了稳定表达红色荧光蛋白的猪naive-like i PS细胞系。 展开更多

关键词 猪诱导性多能干细胞系 多能性 核转染 红色荧光蛋白

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α-半乳糖苷酶A基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立

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作者 冷允俊 刘晓蕊 +3 位作者 李琳 王盈 杨海元 戴一凡 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期688-694,共7页

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化... 目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。通过在线工具在编码催化残基之前的外显子区设计单链向导RNA,构建CRISPR/Cas9打靶载体。将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs,用G418药物筛选出单克隆细胞,并PCR测序鉴定。结果 人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%,相似性为89%;三维结构的均方根偏差值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。成功构建CRISPR/Cas9打靶载体,并筛选出单克隆细胞,PCR测序鉴定其基因型。结论 用生物信息学方法验证了人/猪α-Gal A具有高度的相似性。利用CRISPR/Cas9技术获得了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs细胞系,为构建人类Fabry病猪模型奠定了基础。 展开更多

关键词 FABRY病 α-半乳糖苷酶A基因 Α-半乳糖苷酶A CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞

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猪naive-like胚胎干细胞向神经细胞体外诱导分化

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作者 王晨宇 张曼玲 +8 位作者 姜海滨 金永 赵丽华 刘曼菱 陈俏羽 王俊政 尤志欢 张红 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期829-834,共6页

目的:将猪naive-like胚胎干细胞体外定向诱导分化为神经细胞,为猪多能干细胞诱导神经分化方法的建立提供参考。方法:利用小分子化合物β-巯基乙醇、B-27、肝素等组成的神经诱导培养液,采用直接分化法,分化得到神经样细胞,对其进行神经... 目的:将猪naive-like胚胎干细胞体外定向诱导分化为神经细胞,为猪多能干细胞诱导神经分化方法的建立提供参考。方法:利用小分子化合物β-巯基乙醇、B-27、肝素等组成的神经诱导培养液,采用直接分化法,分化得到神经样细胞,对其进行神经特异性基因表达鉴定,同时检测分化后的细胞是否已经丧失多能性。结果:分化所得到的神经细胞具有明显的神经细胞结构特征,RT-PCR和免疫荧光结果显示分化后的神经细胞表达多种神经细胞特异性基因,qPCR结果显示分化后多能因子的表达显著降低,神经特异性基因表达显著升高,免疫荧光结果经统计分析后显示,低分子量神经微丝蛋白(light neurofilament protein,NF-L)阳性细胞率可达79%。结论:成功实现了体外直接诱导猪naive-like胚胎干细胞向神经细胞分化,为神经系统疾病修复与治疗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪胚胎干细胞 神经细胞 小分子 诱导分化

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利用CRISPR/Cas9技术建立OXTR基因敲除猪胎儿成纤维细胞系

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作者 刘静静 刘晓蕊 +3 位作者 李琳 王盈 杨海元 戴一凡 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期272-278,共7页

利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利... 利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利用在线设计工具设计了2个靶向猪OXTR外显子区的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中,最后将打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单克隆细胞,测序鉴定其基因型。生物信息学分析显示人和猪OXTR基因进化距离较近,氨基酸序列一致性达到91%,相似性为93%,三维结构的RMSD值为0.009。成功构建OXTR基因的Cas9/sgRNA打靶载体,转染PFFs细胞后,药物筛选获得OXTR基因敲除的单克隆细胞并测序证实了基因突变型。人和猪OXTR基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体高效实现了OXTR基因编辑,成功获得基因敲除的单细胞克隆,为后续构建OXTR敲除的巴马猪模型奠定了前期基础。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 OXTR基因 生物信息分析 猪胎儿成纤维细胞

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