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转基因作物对土壤微生物多样性影响研究技术的进展 被引量：9
1
作者 周艳红 丁衬衬 史建荣 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第4期362-365,共4页
土壤微生物的多样性是保持农业生态系统稳定的基础,而作物的改变对土壤微生物的多样性结构具有显著的影响。转基因作物被引入到农田后所带来的微生物群落变化及对农业生态系统所带来的不确定因素,已成为研究热点。本文着重介绍了当前土... 土壤微生物的多样性是保持农业生态系统稳定的基础,而作物的改变对土壤微生物的多样性结构具有显著的影响。转基因作物被引入到农田后所带来的微生物群落变化及对农业生态系统所带来的不确定因素,已成为研究热点。本文着重介绍了当前土壤微生物多样性研究中常用的3种基于16S rDNA的技术:变性梯度凝胶电泳(DGGE)、扩增性核糖体DNA限制酶切片段分析(ARDRA)和末端限制性酶切片段长度多态性(T-RFLP)技术,分析比较了各种技术的原理、优点及其应用局限性,并简短综述了这些技术近年来的应用。 展开更多
关键词 土壤 生物 微生物多样性 16SrDNA DGGE ARDRA T-RFLP
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间接ELISA法检测苏云金芽孢杆菌(Bt)Cry1Ab毒蛋白抗体方法的建立 被引量：2
2
作者 张霄 纪炜 +2 位作者 王耘 温爽 刘贤进 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第4期894-896,共3页
关键词 Cry1Ab毒素 抗体 间接ELISA
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基于双抗夹心的Cry1B毒素蛋白质TRFIA检测方法的建立与评价 被引量：1
3
作者 徐重新 陈莎莎 +4 位作者 张霄 刘媛 张存政 黄鹰 刘贤进 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第1期184-188,共5页
为了建立检测Cry1B毒素蛋白质的双抗夹心时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法,利用稀土元素Eu3+作为示踪剂,以可溶性表达的抗Cry1B毒素蛋白质单链抗体(scFv)作为捕获抗体,以免疫兔血清获得的抗Cry1B毒素蛋白质多克隆抗体为检测抗体,建立检... 为了建立检测Cry1B毒素蛋白质的双抗夹心时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法,利用稀土元素Eu3+作为示踪剂,以可溶性表达的抗Cry1B毒素蛋白质单链抗体(scFv)作为捕获抗体,以免疫兔血清获得的抗Cry1B毒素蛋白质多克隆抗体为检测抗体,建立检测Cry1B抗原的TRFIA技术,并对其进行方法学的综合评价。通过正交试验,获得的最佳单链抗体(Capture antibody)、多克隆抗体(Detection antibody)、Eu3+标记的二抗(Tracer antibody)浓度分别是2.500μg/ml、2.000μg/ml、1.000μg/ml。标准检测曲线灵敏度为0.170 ng/ml,线性测量范围为1.000～800.000 ng/ml。抗原类似物间无交叉反应。Cry1B毒蛋白质在大米中添加回收的批内变异系数为3.8%～6.6%、平均回收率为80.5%～84.8%,批间变异系数为2.2%～8.5%、平均回收率为84.1%～88.4%。表明本试验建立的双抗夹心Cry1B-TRFIA检测范围宽,特异性强,重复性和稳定性好。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 时间分辨免疫分析 单链抗体 多克隆抗体
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亲和短肽用于快速检测转基因蛋白Cry3Bb 被引量：1
4
作者 王耘 武爱华 +3 位作者 刘贤金 谢雅晶 闫娜 张存政 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第3期690-694,共5页
本研究利用竞争洗脱法淘选与Cry3Bb毒素具有亲和力的特异性短肽,以此建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法(IC-ELISA)。经过4轮淘选、富集,获得与靶蛋白具有较高亲和力的B10克隆(ACIHSPTALCGGG)。所建立的检测方法稳定性较好,变异系数在5%... 本研究利用竞争洗脱法淘选与Cry3Bb毒素具有亲和力的特异性短肽,以此建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法(IC-ELISA)。经过4轮淘选、富集,获得与靶蛋白具有较高亲和力的B10克隆(ACIHSPTALCGGG)。所建立的检测方法稳定性较好,变异系数在5%以内;线性检测范围为0.03~29.95μg/ml,线性回归方程为(Y=20.044x+50.407,R2=0.983 4),检测限为0.009 6μg/ml,在玉米样品中提取回收率为92.26%~101.22%。本研究所建立的ELISA检测方法为粮食中Cry3Bb蛋白的定量检测提供了有效的手段,在转基因产品的检验检疫中有较高的应用价值。 展开更多
关键词 Cry3Bb毒素 转基因植物 噬菌体展示肽 间接竞争ELISA
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适体SELEX筛选中单链DNA的制备 被引量：6
5
作者 王丽 贺江 +3 位作者 王耘 雷兆静 屠康 刘贤进 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第5期1133-1136,共4页
探讨建立适体SELEX筛选中单链DNA(ssDNA)的制备方法,生成适体筛选的次级库,为适体SELEX筛选奠定基础。将PCR扩增后带生物素标记的双链DNA(dsDNA)连接在链霉亲和素标记的凝胶上,用NaOH变性解链制备ssDNA。利用荧光法分析dsDNA与凝胶结合... 探讨建立适体SELEX筛选中单链DNA(ssDNA)的制备方法,生成适体筛选的次级库,为适体SELEX筛选奠定基础。将PCR扩增后带生物素标记的双链DNA(dsDNA)连接在链霉亲和素标记的凝胶上,用NaOH变性解链制备ssDNA。利用荧光法分析dsDNA与凝胶结合所需的时间及NaOH对生物素与链霉亲和素标记凝胶结合的影响,在优化的试验条件下制备ssDNA,用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳对其产物进行鉴定。结果显示:生物素标记的dsDNA与链霉亲和素标记的凝胶结合的时间以40 min为佳,0.01 mol/L、0.10 mol/L和1.00 mol/L的NaOH均不影响生物素与链霉亲和素标记凝胶的结合;在优化试验条件下制备的产物为ssDNA。表明采用上述方法制备ssDNA,操作简单、方便,所需时间短,适用于适体SELEX筛选中次级库的生成。 展开更多
关键词 适体 SELEX 双链DNA 单链DNA
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4种有机磷农药DNA适体的筛选及结构分析 被引量：3
6
作者 王丽 刘贤金 +2 位作者 张存政 刘媛 屠康 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期117-122,共6页
利用SELEX技术从一个固定的随机ssDNA库中同时筛选甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果4种有机磷农药的DNA适体。随着筛选轮数的增加,4种有机磷农药从固定的随机库中洗脱的ssDNA逐渐富集,经过12轮的筛选,筛选效率达到40.8%。对第12轮洗... 利用SELEX技术从一个固定的随机ssDNA库中同时筛选甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果4种有机磷农药的DNA适体。随着筛选轮数的增加,4种有机磷农药从固定的随机库中洗脱的ssDNA逐渐富集,经过12轮的筛选,筛选效率达到40.8%。对第12轮洗脱的ssDNA进行克隆、测序,挑选的15个阳性克隆均测序成功,由于部分克隆具有完全一致的序列,最终筛选到5条ssDNA序列。一级结构序列分析表明5条ssDNA具有一定的同源性,二级结构预测表明5条ssDNA的二级结构主要以茎环结构为主,表明茎环结构可能是适体结合4种有机磷农药的基础。 展开更多
关键词 有机磷农药 DNA适体 指数富集的配体系统进化(SELEX) 筛选 结构分析
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饲料中玉米赤霉烯酮的提纯与测定 被引量：3
7
作者 王宏杰 徐剑宏 +3 位作者 祭芳 丁衬衬 董飞 史建荣 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第3期663-667,共5页
玉米赤霉烯酮污染饲料对人、畜造成巨大威胁,因此,对饲料中玉米赤霉烯酮检测水平的提高已不容忽视。为玉米赤霉烯酮监控提供灵敏、可靠的分析方法和试验数据,对其提纯与高效液相色谱测定方法进行了研究,结果表明：样品纯化条件,以二氯... 玉米赤霉烯酮污染饲料对人、畜造成巨大威胁,因此,对饲料中玉米赤霉烯酮检测水平的提高已不容忽视。为玉米赤霉烯酮监控提供灵敏、可靠的分析方法和试验数据,对其提纯与高效液相色谱测定方法进行了研究,结果表明：样品纯化条件,以二氯甲烷和NaCl溶液为提取剂,湿填硅胶柱为富集净化柱,用6 ml的甲醇溶液洗脱,采用HPLC进行测定;高效液相色谱检测条件,流动相为甲醇/水（80∶20,体积比）,流速为0.6 ml/min,紫外检测波长为236 nm,此时最低检出限为5μg/kg,在1.25~40.00μg/ml范围内,被测物浓度与测定的峰面积呈线性关系（r=0.999 1）;通过对检测方法日内、日间加标回收试验得到该检测方法回收率约为96.3%。该方法简便、快速、准确,可适用于饲料中玉米赤霉烯酮的提纯与测定。 展开更多
关键词 玉米赤霉烯酮 纯化 检测 高效液相色谱
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Cry2Aa毒素结合十二肽的筛选与鉴定 被引量：2
8
作者 武爱华 张霄 +5 位作者 刘媛 赵扬 赵岩岩 张存政 谢雅晶 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第4期929-941,共13页
利用Cry-2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选，并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆，进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序，鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示，这20个克隆均能与c巧也Aa毒素发生特... 利用Cry-2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选，并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆，进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序，鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示，这20个克隆均能与c巧也Aa毒素发生特异性结合，并推导出8条不同的序列。挑取阳性值最高的克隆GT（氨基酸序列为GTPWHHHRHLIV）建立了基于十二肽的Cry-2Aa毒蛋白的间接竞争ELISA检测方法。该方法的抑制中浓度（IC50）为1｜1390μg／ml，最低检测限IC10为O．0211μg／ml，线性检测范围为0．0478～22.691Oμg／ml（Y=23．09lgx＋48．692，R^2=0．9963）。噬菌体展示肽库筛选方法为快速、准确地检测Cry2Aa毒蛋白提供了新的途径。 展开更多
关键词 Cry2Aa毒素 噬菌体展示肽库:ELISA
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抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇噬菌体单链抗体库的构建与鉴定 被引量：1
9
作者 周艳红 祭芳 +1 位作者 丁衬衬 史建荣 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第5期1093-1097,共5页
从抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON毒素)杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段,再经重叠延伸PCR拼接扩增得到单链抗体基因(ScFv),克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上。然后转化感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,构建成抗DON毒素噬菌体单链抗体... 从抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON毒素)杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段,再经重叠延伸PCR拼接扩增得到单链抗体基因(ScFv),克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上。然后转化感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,构建成抗DON毒素噬菌体单链抗体库,库容约为1.1×105,滴度为1.3×108pfu。随机选取10个克隆进行双酶切鉴定,结果显示均有ScFv基因片段插入。抗DON毒素单链抗体库的构建,为进一步富集筛选并表达抗DON毒素单链抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 单链抗体 噬菌体抗体库
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玉米中伏马毒素FB_1液相色谱-电喷雾串联质谱测定方法的建立 被引量：3
10
作者 薛秋艳 徐剑宏 +1 位作者 祭芳 史建荣 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第3期627-630,共4页
为建立简单、快速、同时测定玉米中伏马菌素的超高效液相色谱三重四极杆质谱确证方法,利用液相色谱-电喷雾串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定FB1,采用固相萃取富集,以含有0.1%甲酸的甲醇/水(75+25)为流动相,流速0.4 ml/min,以多反应监测(MRM)... 为建立简单、快速、同时测定玉米中伏马菌素的超高效液相色谱三重四极杆质谱确证方法,利用液相色谱-电喷雾串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定FB1,采用固相萃取富集,以含有0.1%甲酸的甲醇/水(75+25)为流动相,流速0.4 ml/min,以多反应监测(MRM)方式进行检测,利用ESI/MS/MS对FB1质谱解析,分别选择特征离子峰m/z334和m/z352作为准确定性的依据。结果表明,在最佳色谱条件下,碰撞能量50 eV,传输区电压100 V时,FB1的保留时间为1.0 min,检出限为75 pg,平均回收率为80.5%,相对标准偏差≤7.47%。以上数据表明该方法具有预处理简单、检测速度快、灵敏度高的优点,可用于玉米样品中伏马菌毒素的确认和准确定量检测,并满足对伏马菌毒素的最低检出要求。 展开更多
关键词 液相色谱-电喷雾串联质谱 玉米 伏马毒素 多离子反应监测
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