一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立

1

作者 贾文凤 蒋香香 +3 位作者 陶慧丽 王安平 吴植 朱善元 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期298-309,共12页

[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其... [目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。 展开更多

关键词 鸭肠炎病毒 CRISPR/Cas9基因编辑 重组载体

在线阅读 下载PDF 职称材料

猪流行性腹泻病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体制备 被引量：1

2

作者 吴婕 杜菁 +8 位作者 樊繁 任金阳 卢会鹏 张力 雷昕诺 曹世诺 吴植 朱睿 朱善元 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4522-4530,共9页

【目的】利用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)核衣壳蛋白(N),并制备具有高效价和特异性强的多克隆抗体。【方法】利用生物信息学工具分析PEDV N蛋白氨基酸序列,并预测其抗原性;利用原核表达载... 【目的】利用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)核衣壳蛋白(N),并制备具有高效价和特异性强的多克隆抗体。【方法】利用生物信息学工具分析PEDV N蛋白氨基酸序列,并预测其抗原性;利用原核表达载体pColdⅠ诱导表达重组N蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用兔多抗制备佐剂与纯化后的重组N蛋白混合后免疫新西兰白兔,收集血清制备多克隆抗体。利用间接ELISA法测定重组N蛋白多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】生物信息学预测结果显示,N蛋白不含信号肽和跨膜结构,具有良好的抗原性和溶解度。SDS-PAGE电泳结果显示,重组N蛋白大小约为58 ku,主要以可溶性蛋白存在;Western blotting结果显示,该蛋白能与抗His标签的鼠源单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA结果显示,多克隆抗体效价可达1∶204800;Western blotting结果表明,抗体稀释度为1∶5000时能特异性识别重组N蛋白及PEDV感染后的Vero细胞样品中的N蛋白;IFA结果显示,当稀释度为1∶1000时,该抗体能有效识别PEDV感染细胞样品中的N蛋白。【结论】本研究成功制备了效价高和特异性好的兔抗N蛋白多克隆抗体,为深入研究PEDV N蛋白的功能、了解PEDV复制机制和病毒-宿主细胞间的互作提供试验材料,为开发PEDV诊断和检测方法奠定基础。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白 原核表达 多克隆抗体

在线阅读 下载PDF 职称材料

16S rRNA甲基化酶基因在鸡源和鸭源沙门菌中的流行特征

3

作者 孙凡 王丽 +6 位作者 董洪燕 吴植 谢军 卢会鹏 王莉 黄亚奇 朱善元 《江苏农业科学》 北大核心 2024年第11期61-67,共7页

氨基糖苷类药物是一种重要的治疗人兽临床上细菌感染的抗菌药物,而16S rRNA甲基化酶是近年新发现的氨基糖苷类药物高度耐药的一种耐药机制。对2021—2022年分离自泰州鸡源和鸭源的143株沙门菌进行阿米卡星抗性平板筛选,并通过PCR方法检... 氨基糖苷类药物是一种重要的治疗人兽临床上细菌感染的抗菌药物,而16S rRNA甲基化酶是近年新发现的氨基糖苷类药物高度耐药的一种耐药机制。对2021—2022年分离自泰州鸡源和鸭源的143株沙门菌进行阿米卡星抗性平板筛选,并通过PCR方法检测耐阿米卡星的菌株是否携带相应的耐药基因。结果显示,沙门菌中armA基因较流行(22/143,15.38%),也有少数菌株携带rmtB基因(1/143,0.70%),其他基因未检测到;不同宿主中,鸡源沙门菌是主要宿主;不同血清型中,印第安纳沙门菌是优势血清型。携带armA基因或rmtB基因的23株阳性菌,阿米卡星的MIC值均高达512μg/mL以上,且表现出多重耐药现象,其中,较为流行的耐药谱是氨苄西林-头孢唑啉-氨曲南-庆大霉素-阿米卡星-萘啶酸-环丙沙星-氯霉素-喹乙醇-复方新诺明-头孢噻肟-链霉素-四环素-氟苯尼考-磷霉素。国内外关于16S rRNA甲基化酶基因在沙门菌中的研究相对较少。本研究结果可为生产实践中耐药菌株的快速监测提供参考,也可为动物临床或养殖业中合理使用氨基糖苷类药物提供理论依据。 展开更多

关键词 鸡源 鸭源 沙门菌 16S rRNA甲基化酶基因 耐药性

在线阅读 下载PDF 职称材料

表达鸭坦布苏病毒衣壳蛋白的重组腺病毒载体构建与鉴定

4

作者 吴庆国 李莎莎 +2 位作者 王安平 卢会鹏 成玉婷 《中国家禽》 北大核心 2024年第3期51-57,共7页

为构建鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,研究通过一步克隆技术将DTMUV Capsid基因插入到含有结核分枝杆菌的热休克蛋白70(mHsp70)为佐剂的pShuttle-CMV-Hsp70质粒中,构... 为构建鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,研究通过一步克隆技术将DTMUV Capsid基因插入到含有结核分枝杆菌的热休克蛋白70(mHsp70)为佐剂的pShuttle-CMV-Hsp70质粒中,构建能够表达DTMUV Capsid和mHsp70蛋白的重组穿梭质粒pShuttle-DTMUV Capsid,并与含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-DTMUV Capsid。载体质粒经Pac I酶切线性化后转染至HEK 293A细胞,包装重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid。结果显示,rAdv-DTMUV Capsid在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达2.3×10^(8)PFU/mL。Western blot等结果表明rAdv-DTMUV Capsid在HEK 293A细胞中表达了DTMUV特异性蛋白Capsid。DEF细胞感染试验证明rAdv-DTMUV Capsid可感染鸭源细胞,且诱导IFN-α、IL-10和IL-17 mRNA表达。结果表明,研究成功制备表达DTMUV Capsid蛋白的重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid,能引起细胞免疫反应,可作为一种候选疫苗。 展开更多

关键词 鸭坦布苏病毒 衣壳蛋白 重组腺病毒 HSP70

在线阅读 下载PDF 职称材料

饲粮中消化能、粗蛋白质和粗纤维水平对育肥苏姜猪生长性能、胴体性状和肉品质的影响 被引量：15

5

作者 周根来 赵旭庭 +5 位作者 陶勇 殷洁鑫 任善茂 倪黎纲 张君胜 周春宝 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期3293-3301,共9页

本试验旨在研究饲粮中消化能、粗蛋白质和粗纤维水平对育肥苏姜猪生长性能、胴体性状及肉品质的影响。试验选用162头体重(50.49±4.78)kg的苏姜猪,随机分为9组,每组3个重复,每个重复6头(公母各占1/2)。采用3因素3水平正交试验设计,... 本试验旨在研究饲粮中消化能、粗蛋白质和粗纤维水平对育肥苏姜猪生长性能、胴体性状及肉品质的影响。试验选用162头体重(50.49±4.78)kg的苏姜猪,随机分为9组,每组3个重复,每个重复6头(公母各占1/2)。采用3因素3水平正交试验设计,消化能水平分别为11.64、12.24、12.84 M J/kg,粗蛋白质水平分别为12%、13%、14%,粗纤维水平分别为5%、8%、11%,配制9种饲粮。预试期7 d,正试期42 d。结果显示:1)11.64 M J/kg消化能组平均日采食量(ADFI)极显著高于12.24、12.84 MJ/kg消化能组(P<0.01);饲粮消化能水平对试验猪的平均日增重(ADG)、料重比(F/G)无显著影响(P>0.05)。饲粮粗蛋白质水平对试验猪的ADG、ADFI和F/G均无显著影响(P>0.05)。8%和11%粗纤维组的ADG、ADFI、F/G分别显著高于(P<0.05)、极显著低于(P<0.01)、极显著低于(P<0.01)5%粗纤维组。2)12.24 MJ/kg消化能组屠宰率和胴体长显著高于11.64 MJ/kg消化能组(P<0.05);11%粗纤维组平均背膘厚极显著低于5%粗纤维组(P<0.01)。3)12.84 MJ/kg消化能组的肌肉红度值极显著高于11.64和12.24 M J/kg消化能组(P<0.01);13%粗蛋白质组肌肉p H24 h显著低于12%粗蛋白质组(P<0.05);8%和11%粗纤维组肌内脂肪含量极显著低于5%粗纤维组(P<0.01)。综合考虑上述因素,育肥苏姜猪饲粮中消化能、粗蛋白质、粗纤维的适宜水平分别为12.24 MJ/kg、12%、11%。 展开更多

关键词 苏姜猪 消化能水平 粗蛋白质水平 粗纤维水平 生长性能 胴体性状 肉品质

在线阅读 下载PDF 职称材料

日粮营养水平对育肥苏姜猪血清生化指标和肉质相关基因的影响 被引量：12

6

作者 周根来 陶勇 +6 位作者 倪黎纲 任善茂 徐盼 殷洁鑫 张君胜 周春宝 赵旭庭 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期668-677,共10页

【目的】研究日粮不同消化能(DE)、粗蛋白(CP)和粗纤维(CF)水平对育肥阶段苏姜猪血清生化指标和肉质相关基因的影响。【方法】选用162头体重(50.49±4.78)kg的苏姜猪,设定不同DE(11.64、12.24、12.84MJ·kg^-1)、CP(12%、13%、1... 【目的】研究日粮不同消化能(DE)、粗蛋白(CP)和粗纤维(CF)水平对育肥阶段苏姜猪血清生化指标和肉质相关基因的影响。【方法】选用162头体重(50.49±4.78)kg的苏姜猪,设定不同DE(11.64、12.24、12.84MJ·kg^-1)、CP(12%、13%、14%)及CF(5%、8%、11%)水平,采用L9(3^4)正交试验设计,设置9组日粮处理,每组3个重复,每个重复6头(公母各半)。预饲期7d,试验期42d。【结果】(1)血清生化指标:12.84MJ·kg^-1DE组总蛋白含量显著高于11.64MJ·kg^-1DE组(P<0.05);12.84MJ·kg^-1DE组球蛋白含量均极显著高于11.64、12.24MJ·kg^-1DE组(P<0.01);8%、11%CF组尿氮含量分别极显著(P<0.01)、显著(P<0.05)高于5%CF组;13%、14%两CP组总胆固醇含量极显著低于12%CP组(P<0.01),14%CP组甘油三酯含量极显著低于12%CP组(P<0.01);11%CF组葡萄糖含量极显著低于5%CF组(P<0.01),12.84MJ·kg^-1DE组肌酐含量显著低于11.64MJ·kg^-1DE组(P<0.05)。(2)血清激素及酶活:12.84MJ·kg^-1DE组血清胰岛素水平显著高于11.64MJ·kg^-1DE组(P<0.05),11%CF组血清中三碘甲腺原氨酸含量显著低于5%CF组(P<0.05)。日粮营养水平对试验猪血清中各酶活没有显著影响(P>0.05)。(3)肉质相关基因:11.64MJ·kg^-1DE组背最长肌H-FABP、PRAKG3基因的表达量显著高于12.24、12.84MJ·kg^-1两DE组(P<0.05),HSL基因表达量极显著高于12.24、12.84MJ·kg^-1两DE组(P<0.01);日粮CP和CF水平对试验猪各基因表达均没有显著影响(P>0.05)。【结论】日粮中不同DE、CP和CF水平可通过调控血清生化指标和肉质相关基因表达影响育肥苏姜猪的生长发育,育肥苏姜猪适宜的DE、CP和CF水平分别为12.84MJ·kg^-1、12%、11%。 展开更多

关键词 苏姜猪 日粮营养水平 生化指标 激素水平 酶活 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

不同水平豌豆蛋白粉对高邮鸭生长及其相关激素与基因表达的影响 被引量：6

7

作者 周根来 杨晓志 +2 位作者 殷洁鑫 周明夏 左伟勇 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期635-640,共6页

【目的】本试验研究了豌豆蛋白粉对0~4周龄高邮鸭生长性能、血清激素以及与生长相关基因表达的影响。【方法】试验选用160只1日龄高邮鸭,随机分为4组,每组4个重复,每个重复10只鸭。对照组(C0组)饲喂基础饲粮,试验组(C1、C2、C3组)分别... 【目的】本试验研究了豌豆蛋白粉对0~4周龄高邮鸭生长性能、血清激素以及与生长相关基因表达的影响。【方法】试验选用160只1日龄高邮鸭,随机分为4组,每组4个重复,每个重复10只鸭。对照组(C0组)饲喂基础饲粮,试验组(C1、C2、C3组)分别饲喂以3%、6%、9%的豌豆蛋白粉替代基础饲粮中豆粕的试验饲粮,试验期为28 d。【结果】(1)试验组C1、C3鸭日增重和采食量均极显著低于对照组(P<0.01),C2日增重和采食量显著低于对照组(P<0.05)。试验组C1料重比显著高于对照组(P<0.05),C2、C3料重比与对照组差异不显著(P>0.05)。(2)试验组血清GH、Insulin、Leptin和IGF-I激素水平与对照组差异不显著(P>0.05),试验组C2和C3的IGF-I水平显著高于试验组C1(P<0.05)。(3)试验组对鸭肌肉中GH表达量的影响与对照组差异不显著,但表达量均有所提高。试验组对Insulin表达量没有显著影响,试验组C2腿肌中Obese基因表达量显著高于对照组C0(P<0.05)。试验组C2、C3相对于对照组上调了肌肉组织中IGF-I的表达量(P>0.05),而试验组C2中腿肌IGF-I表达量显著高于对照组(P<0.05)。【结论】综上研究结果,饲粮中用6%豌豆蛋白粉代替部分豆粕后养分利用率最高,对血清激素水平没有显著影响,但促进了GH等生长相关基因的表达,特别是上调了腿肌中IGF-I的表达。 展开更多

关键词 豌豆蛋白粉 高邮鸭 生长性能 血清激素 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

生长肥育阶段姜曲海猪饲粮中适宜粗纤维水平的研究 被引量：4

8

作者 周根来 倪黎纲 +5 位作者 张伟 殷洁鑫 任善茂 许琴瑟 陈章言 赵旭庭 《家畜生态学报》 北大核心 2020年第5期23-29,共7页

研究旨在评价饲粮不同粗纤维(CF)水平对姜曲海猪生长性能、胴体性状、肉品质以及血清生化指标的影响以探究其适宜的粗纤维需要量。选取96头体重为(27.61±2.15)kg健康姜曲海猪,随机分为4个处理,每处理4个重复,每个重复6头猪(公母各... 研究旨在评价饲粮不同粗纤维(CF)水平对姜曲海猪生长性能、胴体性状、肉品质以及血清生化指标的影响以探究其适宜的粗纤维需要量。选取96头体重为(27.61±2.15)kg健康姜曲海猪,随机分为4个处理,每处理4个重复,每个重复6头猪(公母各半),分别饲喂4种饲粮,粗纤维水平分别为4%(对照组)、7%、10%和13%。预饲期7 d,正试期120 d。结果表明:(1)与对照组相比,13%CF组的平均日增重和平均日采食量显著降低(P<0.05)。10%CF组的料重比与对照组没有显著差异,但结果最低,且显著低于13%CF组(P<0.05)。(2)7%CF组、10%CF组和13%CF组的板油比例均显著低于对照组(P<0.05),10%CF组和13%CF组的平均背膘厚显著低于对照组(P<0.05)。(3)与对照组相比,10%CF组显著降低了背最长肌剪切力(P<0.05),13%CF组显著降低了大理石评分(P<0.05),7%CF组、10%CF组和13%CF组背最长肌粗脂肪含量显著降低(P<0.05)。(4)10%CF组的谷草转氨酶活性显著低于对照组(P<0.05),3个试验组的乳酸脱氢酶活性均显著低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,10%CF组和13%CF组显著降低了血清甘油三酯水平(P<0.05)、显著提高了血清肌酐和葡萄糖水平(P<0.05),7%CF组显著降低了血清胆固醇水平(P<0.05),13%CF组显著降低了血清高密度脂蛋白水平(P<0.05),3个试验组均显著降低了血清低密度脂蛋白水平(P<0.05)。研究结果显示,姜曲海猪具有较强的耐粗饲能力,其生长育肥期饲粮粗纤维水平以10%为宜。 展开更多

关键词 姜曲海猪 粗纤维 肉品质 生长性能 胴体性状 血清生化指标

在线阅读 下载PDF 职称材料

豆粕和豌豆蛋白粉的常规养分含量及鸭消化率的比较分析 被引量：4

9

作者 周根来 杨晓志 +1 位作者 殷洁鑫 张栋 《家畜生态学报》 北大核心 2016年第8期20-23,共4页

通过化学分析和鸭消化试验来比较评定豆粕和豌豆蛋白粉的营养价值。采用化学分析法分别测定豌豆蛋白粉和豆粕中干物质(DM)、粗灰分(Ash)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、粗纤维(CF)、无氮浸出物(NFE)、钙(Ca)和总磷(TP)的含量。选择12只20周... 通过化学分析和鸭消化试验来比较评定豆粕和豌豆蛋白粉的营养价值。采用化学分析法分别测定豌豆蛋白粉和豆粕中干物质(DM)、粗灰分(Ash)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、粗纤维(CF)、无氮浸出物(NFE)、钙(Ca)和总磷(TP)的含量。选择12只20周龄的健康状况良好的高邮鸭,随机分为2组(每组6个重复),利用排空强饲法分别测定豌豆蛋白粉和豆粕的粗蛋白、粗脂肪、钙和总磷的表观消化率。结果表明:豌豆蛋白粉中DM、CP、EE、CF、NFE、Ash、Ca、TP的含量分别为89.07%、56.08%、3.15%、4.98%、21.80、2.86%、1.01%、0.63%,而豆粕中相应指标值分别为89.64%、44.34%、1.95%、6.13%、30.95%、6.27%、0.53%、0.62%;20周龄高邮鸭豌豆蛋白粉的CP表观消化率为77.24%,显著低于豆粕的CP表观消化率85.77%(P<0.05);对豌豆蛋白粉的EE、Ca和TP的表观消化率分别为86.10%、60.75%和71.49%,而豆粕的EE、Ca和TP的表观消化率分别为89.11%、64.75%和70.01%。试验结果表明,高邮鸭对豌豆蛋白粉和豆粕中几种主要营养成分的表观消化率存在较大差异,豆粕对高邮鸭的营养价值略高于豌豆蛋白粉。但结合常规养分含量的化学分析,豌豆蛋白粉在CP、CF和Ca等养分含量方面具有比较优势。 展开更多

关键词 豌豆蛋白粉 豆粕 营养成分 强饲法 表观消化率

在线阅读 下载PDF 职称材料

鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析 被引量：4

10

作者 吴植 董洪燕 +4 位作者 郭长明 谢军 宋海港 顾陈怡 朱善元 《中国家禽》 北大核心 2023年第10期122-126,共5页

为确定江苏徐州地区某肉鸭养殖场发病原因,试验采集该鸭场病死鸭内脏器官进行常见病毒病的核酸检测、细菌的分离鉴定、血清型鉴定、半数致死量测定和药物敏感性试验,分析其致病力和耐药性。结果显示:鸭坦布苏病毒(DTMUV)等常见8种病毒... 为确定江苏徐州地区某肉鸭养殖场发病原因,试验采集该鸭场病死鸭内脏器官进行常见病毒病的核酸检测、细菌的分离鉴定、血清型鉴定、半数致死量测定和药物敏感性试验,分析其致病力和耐药性。结果显示:鸭坦布苏病毒(DTMUV)等常见8种病毒检测核酸阴性;经过形态学观察、生化试验和PCR鉴定确定为鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA),将其命名为FX04株;凝集试验显示为血清3型;FX04株对多黏菌素B和氟苯尼考敏感;FX04株半数致死量(LD50)为6.2×10^(6)cfu。结果表明,该鸭场发生了血清3型鸭疫里默氏杆菌感染,且对多种抗生素耐药且致病性较强,建议选用高敏药物进行治疗,并加强对血清3型RA的监测和防控。 展开更多

关键词 鸭疫里默氏杆菌 分离鉴定 药敏试验

在线阅读 下载PDF 职称材料

鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定 被引量：2

11

作者 张力 许加龙 +8 位作者 黄锦钰 许子月 雷昕诺 卢会鹏 朱睿 孙伟翔 曹海月 王安平 朱善元 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4186-4195,共10页

旨在建立鹅骨骼肌卫星细胞体外分离、培养、纯化及鉴定的方法。本研究选取健康10周龄溆浦鹅仔鹅为试验材料,采用分散酶Dispase II和胶原酶II共同作用肌肉组织分离得到卫星细胞,利用差速贴壁法纯化卫星细胞,在体外培养过程中,含有20%FBS... 旨在建立鹅骨骼肌卫星细胞体外分离、培养、纯化及鉴定的方法。本研究选取健康10周龄溆浦鹅仔鹅为试验材料,采用分散酶Dispase II和胶原酶II共同作用肌肉组织分离得到卫星细胞,利用差速贴壁法纯化卫星细胞,在体外培养过程中,含有20%FBS并添加bFGF的DMEM/F12生长完全培养基能较好维持卫星细胞的分化潜能,培养过程中涉及的培养皿需经基质胶特别包被处理;诱导分化出成熟肌管后,采用免疫荧光法和Western blotting检测肌球蛋白重链MyHC的表达,采用qRT-PCR检测Pax7、MyoD1、MyoG基因在诱导分化前(growth medium,GM)和分化后(differentiation medium,DM)的相对表达量,分化前后每组均3个重复。结果表明,新分离得到的卫星细胞体积较小,折光性强,贴壁后呈中间彭起两端针状的梭形结构,经免疫荧光鉴定呈Pax7阳性;诱导分化后可形成成熟多核肌管,免疫荧光检测成肌特异性标志MyHC呈阳性,统计分化指数高达78%(P<0.01);qRT-PCR检测标志性基因Pax7、MyoD1、MyoG呈阳性,并且分化前Pax7基因相对表达量是分化后的2.22倍(P<0.01),而分化后标志性基因MyoD1、MyoG的相对表达量分别是分化前的1.90(P<0.01)和44.22倍(P<0.01);Western blotting结果显示分化后MyHC蛋白表达水平明显升高。综上所述,本研究建立了一种基于胶原酶Ⅱ和分散酶Dispase II的混合酶分离鹅骨骼肌卫星细胞的方法,提供的培养体系能够使细胞在体外培养过程中维持巨大的分化潜能,为鹅肌肉组织生长发育分子调控机制的研究提供了良好的细胞模型。 展开更多

关键词 鹅 骨骼肌卫星细胞 分离 培养 鉴定

在线阅读 下载PDF 职称材料

豌豆蛋白粉对1~4周龄高邮鸭生长性能、养分表观消化率、消化器官发育及血清生化指标的影响 被引量：1

12

作者 周根来 杨晓志 +2 位作者 殷洁鑫 周明夏 左伟勇 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期3648-3656,共9页

本试验旨在研究豌豆蛋白粉对1~4周龄高邮鸭生长性能、养分表观消化率、消化器官发育及血清生化指标的影响。试验选用160只1日龄高邮鸭,随机分为4个组,每组4个重复,每个重复10只鸭。对照组(C0组)饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,试验组(C1、C2... 本试验旨在研究豌豆蛋白粉对1~4周龄高邮鸭生长性能、养分表观消化率、消化器官发育及血清生化指标的影响。试验选用160只1日龄高邮鸭,随机分为4个组,每组4个重复,每个重复10只鸭。对照组(C0组)饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,试验组(C1、C2、C3组)分别饲喂以3%、6%、9%的豌豆蛋白粉替代基础饲粮中豆粕的试验饲粮。试验期28 d。结果表明:1)C1、C2、C3组的平均日增重和平均日采食量均显著低于对照组(P<0.05);C1组的料重比显著高于对照组(P<0.05),C2、C3组的料重比与对照组差异不显著(P>0.05)。2)C1、C2、C3组的粗蛋白质(CP)和总磷(TP)表观消化率与对照组差异不显著(P>0.05),C2组的粗纤维(CF)、粗脂肪(EE)和钙(Ca)表观消化率与对照组差异不显著(P>0.05),C1、C3组的CF、EE和Ca表观消化率均显著低于对照组(P<0.05)。3)豌豆蛋白粉对腺胃、胰腺和十二指肠的相对重量没有显著影响(P>0.05)。C1组的肌胃相对重量显著高于对照组(P<0.05),C2组的空肠和回肠相对重量均显著高于对照组(P<0.05),C2组的十二指肠密度、空肠密度和回肠相对长度均显著高于对照组(P<0.05)。4)豌豆蛋白粉对血清白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)含量没有显著影响(P>0.05),C3组的血清总蛋白(TP)含量显著高于对照组(P<0.05),C2、C3组的血清尿素氮(UN)含量均显著高于对照组(P<0.05),C1、C2、C3组的血清甘油三酯(TG)含量均显著高于对照组(P<0.05),C1、C3组的血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)含量显著低于对照组(P<0.05)。综上,饲粮中使用豌豆蛋白粉替代豆粕会降低1~4周龄高邮鸭的平均日增重和平均日采食量,但6%豌豆蛋白粉替代豆粕对养分表观消化率没有显著影响,料重比低于对照组,而且有助于小肠器官发育指数提高,影响体内蛋白质和脂肪代谢的变化。建议6%豌豆蛋白粉作为高邮鸭饲粮的推荐使用量。 展开更多

关键词 豌豆蛋白粉 高邮鸭 生长性能 养分表观消化率 消化器官 血清生化指标

在线阅读 下载PDF 职称材料

纳米氧化锌绿色合成及其体外抗PRRSV效果 被引量：1

13

作者 封琦 秦枫 +2 位作者 韦创创 郑凯毅 朱善元 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第4期111-119,共9页

本研究评估了水花生植物提取物绿色合成纳米氧化锌的可行性并评价了其对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的体外抗病毒效果。采用紫外-可见光谱、扫描电镜观察以及能谱扫描仪分析等多种方法交互验证纳米氧化锌颗粒的形成,并采用MTT比色法... 本研究评估了水花生植物提取物绿色合成纳米氧化锌的可行性并评价了其对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的体外抗病毒效果。采用紫外-可见光谱、扫描电镜观察以及能谱扫描仪分析等多种方法交互验证纳米氧化锌颗粒的形成,并采用MTT比色法在预防、阻断、直接灭活三种药物作用方式下对其体外抗PRRSV的活性进行评估。结果表明纳米氧化锌颗粒在反应液中呈胶体状态,最大吸收峰在波长260 nm处;晶体颗粒呈六棱柱形,其粒径为34.8~314.2 nm,平均尺寸为43.8 nm。纳米氧化锌药物细胞安全质量浓度为0.125 mg/mL。纳米氧化锌针对PRRSV在预防、阻断以及直接杀灭三种作用方式下对细胞的最高平均保护率分别为35.1%、63.7%、73.9%。结果提示,纳米氧化锌在开发作为抗PRRSV的消毒剂以及阻断剂方面很有应用前景。该研究说明利用水花生植物提取液可以合成纳米氧化锌颗粒,而且显示了良好的体外抗病毒效果,这也为今后新兽药研发以及入侵植物资源化利用提供了借鉴。 展开更多

关键词 绿色合成 纳米氧化锌颗粒 水花生 猪繁殖与呼吸综合征病毒 抗病毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

高邮鸭对豆粕和豌豆蛋白粉的氨基酸消化率的比较研究 被引量：1

14

作者 周根来 杨晓志 +1 位作者 殷洁鑫 左伟勇 《江苏农业科学》 2018年第1期111-115,共5页

通过鸭代谢试验和化学分析比较测定豆粕和豌豆蛋白粉的氨基酸利用率以及养分含量。选择18羽20周龄健康状况良好的高邮鸭,随机分为3个处理,每个处理6个重复。处理1为豌豆蛋白粉强饲组,处理2为豆粕强饲组,处理3为饥饿组,用以测定内源损失... 通过鸭代谢试验和化学分析比较测定豆粕和豌豆蛋白粉的氨基酸利用率以及养分含量。选择18羽20周龄健康状况良好的高邮鸭,随机分为3个处理,每个处理6个重复。处理1为豌豆蛋白粉强饲组,处理2为豆粕强饲组,处理3为饥饿组,用以测定内源损失,分别测定和计算豌豆蛋白粉和豆粕的氨基酸消化率、可消化氨基酸含量。豌豆蛋白粉和豆粕中干物质(DM)、粗灰分(ASH)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、粗纤维(CF)、钙(Ca)、总磷(TP)和各种氨基酸(AA)的含量采用化学分析法分别进行测定。结果表明,(1)豌豆蛋白粉中CP、EE、CF、Ca、TP的含量分别为56.08%、3.15%、4.98%、1.01%、0.63%,而豆粕中相应值分别为44.34%、1.95%、6.13%、0.53%、0.62%;(2)豌豆蛋白粉的表观可消化总氨基酸含量、真可消化总氨基酸含量分别为271.10、283.31 mg/g,均极显著低于豆粕的相应含量303.55、315.88 mg/g(P<0.01);(3)豆粕中赖氨酸、异亮氨酸和组氨酸3种必需氨基酸,天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸5种非必需氨基酸的可消化含量极显著高于豌豆蛋白粉中相应氨基酸值(P<0.01),而豌豆蛋白粉中可消化蛋氨酸、丙氨酸含量极显著高于豆粕中含量(P<0.01)。综上所述,高邮鸭对豌豆蛋白粉和豆粕中各种氨基酸的消化率具有较大差异,豆粕对鸭的营养价值高于豌豆蛋白粉。但豌豆蛋白粉的蛋白含量较高,可消化蛋氨酸含量丰富,可作为蛋白质饲料应用于鸭养殖。 展开更多

关键词 豌豆蛋白粉 豆粕 氨基酸消化率 强饲法 鸭养殖

在线阅读 下载PDF 职称材料

非常规饲料豌豆蛋白粉的应用研究 被引量：2

15

作者 周根来 刘敬盛 《饲料研究》 CAS 2015年第19期33-36,共4页

我国畜牧业发展迅速,但饲料原料短缺问题日益突出,尤其是蛋白质饲料的供给已成为制约畜牧业持续健康发展的重要因素。对非常规饲料资源豌豆蛋白粉的来源、加工工艺和营养特点进行介绍,研究其在动物生产中的应用现状,分析豌豆蛋白粉作为... 我国畜牧业发展迅速,但饲料原料短缺问题日益突出,尤其是蛋白质饲料的供给已成为制约畜牧业持续健康发展的重要因素。对非常规饲料资源豌豆蛋白粉的来源、加工工艺和营养特点进行介绍,研究其在动物生产中的应用现状,分析豌豆蛋白粉作为蛋白质原料的优势和存在问题,并提出扩大其应用范围的相关建议。 展开更多

关键词 豌豆蛋白粉 营养特点 应用 存在问题

在线阅读 下载PDF 职称材料

非洲猪瘟病毒无标签p35蛋白的制备及间接ELISA抗体检测方法的建立

16

作者 吴植 卢会鹏 +4 位作者 王安平 谢军 曹世诺 徐艳 朱善元 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第5期1209-1216,共8页

为了进一步提高非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的特异性,本研究构建了类弹性蛋白(ELP)标签与ASFV p35融合表达载体,利用相变循环分离纯化融合蛋白后,用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)切除ELP标签,制备获得无标签... 为了进一步提高非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的特异性,本研究构建了类弹性蛋白(ELP)标签与ASFV p35融合表达载体,利用相变循环分离纯化融合蛋白后,用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)切除ELP标签,制备获得无标签p35蛋白,以此为包被抗原,通过一系列的条件摸索和优化,建立ASFV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,ELP-p35融合蛋白的相对分子质量大小约为80000;制备获得的无标签p35蛋白能够被非洲猪瘟阳性血清所识别;抗原包被最佳质量浓度为2.00μg/ml,待检血清最佳稀释比例为1∶200,二抗最佳稀释比例为1∶10000,阴性和阳性判定阈值OD450为0.171;与口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病毒(PRV)等阳性血清无交叉反应,特异性好;批内、批间试验结果显示变异系数都小于5.000%,重复性好;可检测400倍稀释的血清,敏感性较高;与商品化检测试剂盒(ING)检测结果的符合率高达100%。结果表明,用本研究制备的ASFV无标签p35蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于ASFV抗体的检测,为该病的进一步精准检测提供了技术手段。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 类弹性蛋白 无标签p35蛋白 间接ELISA方法

在线阅读 下载PDF 职称材料

一株鸡源血清4型禽腺病毒的分离鉴定及动物回归试验

17

作者 吴植 黄佳 +5 位作者 吴双 谢军 顾陈怡 徐艳 张聪 袁慧莎 《畜牧兽医科技信息》 2023年第8期53-55,共3页

自2015年以来,心包积液-肝炎综合征在我国部分地区暴发并造成大量肉鸡死亡,给养殖户造成巨大的经济损失。本研究对广西某养殖场送检的疑似感染禽腺病毒感染的发病鸡进行了病毒分离,收集尿囊液进行PCR扩增和序列测定,并进行了动物回归试... 自2015年以来,心包积液-肝炎综合征在我国部分地区暴发并造成大量肉鸡死亡,给养殖户造成巨大的经济损失。本研究对广西某养殖场送检的疑似感染禽腺病毒感染的发病鸡进行了病毒分离,收集尿囊液进行PCR扩增和序列测定,并进行了动物回归试验。测序结果显示该分离株与禽腺病毒(FAdV)血清4型参考株同源性高达99.2%;动物回归实验剖检攻毒鸡可见心包积液、肝炎综合征等明显病理变化,与禽腺病毒4型感染出现病变一致。本研究分离获得的病毒为血清4型禽腺病毒(FAdV-4),进一步探究其致病机理提供了实验基础。 展开更多

关键词 禽腺病毒 分离鉴定 血清4型 动物回归试验

在线阅读 下载PDF 职称材料

E亚群禽白血病病毒分离株的全基因组序列分析 被引量：4

18

作者 吴植 吴双 +3 位作者 袁慧莎 张聪 朱善元 范红结 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期134-141,共8页

为了弄清江苏省某一地方品种种鸡场病死鸡的死亡原因,采集病死鸡组织,检测显示仅为ALV阳性;通过CEF和DF-1细胞培养、p27抗原检测和间接免疫荧光(IFA)对病毒进行鉴定;对病毒分离株前病毒DNA序列进行全基因组序列测定与分析。结果显示:分... 为了弄清江苏省某一地方品种种鸡场病死鸡的死亡原因,采集病死鸡组织,检测显示仅为ALV阳性;通过CEF和DF-1细胞培养、p27抗原检测和间接免疫荧光(IFA)对病毒进行鉴定;对病毒分离株前病毒DNA序列进行全基因组序列测定与分析。结果显示:分离株能够在CEF上生长,上清液中可检测到p27抗原,CEF出现特异性绿色荧光,DF-1细胞培养物以上检测均为阴性,初步表明分离株为ALV-E,命名为JY202106;其基因组大小为7529 bp,符合复制完整型C型反转录病毒特征,缺乏肿瘤基因;序列分析显示,分离株与参考株同源性为84.3%~98.7%,gp85进化分析分离株与ALV-E同属一个进化分支,与ev-1株同源性高达99.2%。研究表明地方品种鸡中存在内源性ALV,为该病的防控提供了参考和依据,也丰富了ALV基因组数据资料。 展开更多

关键词 禽白血病病毒 E亚群 分离鉴定 基因组分析

在线阅读 下载PDF 职称材料

鹅星状病毒Ⅰ型荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：4

19

作者 谢军 张硕 +3 位作者 王安平 吴植 吴双 朱善元 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期106-112,共7页

本研究根据鹅Ⅰ型星状病毒(GAstV-1)的保守基因序列设计一对特异性引物和探针,建立并优化荧光定量PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感性、重复性进行了试验,且采用田间样品进行验证。结果显示,本研究建立的检测方法与新城疫病毒(NDV... 本研究根据鹅Ⅰ型星状病毒(GAstV-1)的保守基因序列设计一对特异性引物和探针,建立并优化荧光定量PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感性、重复性进行了试验,且采用田间样品进行验证。结果显示,本研究建立的检测方法与新城疫病毒(NDV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、禽流感病毒AIV(H9N2)、鹅细小病毒(GPV)、鹅圆环病毒(GoCV)、水禽大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里默氏杆菌(RA)均无交叉反应;对重组质粒标准品的检测限为1.0×10^(1)copies/μL,组内和组间的变异系数均≤1.00%。13份田间临床样品检测结果显示,本研究建立的荧光定量PCR法阳性检出率为100%。由此可见,本研究建立的GAstV-1荧光定量PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,为鹅星状病毒的检测和监测提供了有效的技术手段方法。 展开更多

关键词 星状病毒 荧光定量PCR 检测方法

在线阅读 下载PDF 职称材料

梓醇抑制Galectin-3和CD146互作改善AGEs致肝窦内皮细胞的损伤作用 被引量：2

20

作者 孙伟翔 宗莹莹 +5 位作者 刘博 庄远 秦枫 陈毓 朱善元 许惠琴 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2820-2831,共12页

【目的】探讨梓醇通过影响半乳糖凝集素-3(Galectin-3)和CD146的相互作用改善晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)导致大鼠肝窦内皮细胞(rat liver sinusoidal endothelial cells,RLSECs)的炎性损伤作用。【方法... 【目的】探讨梓醇通过影响半乳糖凝集素-3(Galectin-3)和CD146的相互作用改善晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)导致大鼠肝窦内皮细胞(rat liver sinusoidal endothelial cells,RLSECs)的炎性损伤作用。【方法】用不同浓度(0、0.1、1、10μmol/L)梓醇分别孵育RLSECs 48 h后,采用CCK-8法观察细胞增殖情况。用10μmol/L梓醇孵育RLSECs 0、12、24、48、96 h,同上法观察细胞增殖情况。设Control(空白对照组)、AGEs(AGEs处理)、Cat1(1μmol/L梓醇)、Cat10(10μmol/L梓醇)和阳性对照GB1107组(1μmol/L GB1107),Cat1、Cat10和GB1107组加入相应含量的药物培养基孵育30 min后,除Control组外其他组均在培养基中加入终浓度为200μg/mL的AGEs刺激,观察以上各组的RLSECs形态变化,采用乳酸脱氢酶(lactate hydrogenase,LDH)法检测细胞的损伤程度,采用ELISA法观察各组单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的分泌量。将巨噬细胞RAW264.7种板,同上法分组并给药,48 h后采用Griess法观察各组一氧化氮(nitric oxide,NO)向细胞上清液的释放量。将RAW264.7细胞种于Transwell小室,RLSECs种于孔板底部,设Control、AGEs、Cat10、Cat10+LV-Galectin-3-GFP、Cat10+LV-Galectin-3-shRNA组,后两组先转染慢病毒48 h,再分别给药30 min后,除Control组外在培养基中加入终浓度为200μg/mL的AGEs刺激,48 h后用结晶紫法观察巨噬细胞的透膜细胞数量。将Control、AGEs、Cat10、GB1107组的RLSECs孵育药物48 h后,采用免疫荧光法观察Galectin-3和CD146的共定位情况。将Control、AGEs和Cat10组的蛋白样品通过Western blotting和免疫共沉淀(Co-IP)法检测Galectin-3和CD146的相互作用以及各自的表达量。【结果】与Control组相比,Cat0.1组RLSECs增殖率无显著差异(P>0.05),Cat1和Cat10组RLSECs增殖率显著升高(P<0.05);与孵育0 h组相比,10μmol/L梓醇孵育48 h组RLSECs增殖率显著上升(P<0.05)。因此,后续试验选用10μmol/L梓醇孵育48 h为最适试验条件。与AGEs组相比,Cat1和Cat10组改善AGEs导致的细胞损伤,RLSECs上清液LDH活力及MCP-1、ICAM-1的释放量显著降低(P<0.05)。与AGEs组相比,梓醇组抑制巨噬细胞RAW264.7的激活作用,细胞NO的释放量显著降低(P<0.05)。通过慢病毒载体过表达和敲低RLSECs和RAW264.7的Galectin-3,证明了梓醇通过抑制该分子表达可显著改善巨噬细胞的浸润作用(P<0.05)。与AGEs组相比,Cat10组Galectin-3与CD146的结合被显著抑制(P<0.05),且不影响两种分子的各自表达量(P>0.05)。【结论】梓醇通过促进AGEs致Galectin-3和CD146分子复合物的解偶联作用,改善AGEs致肝窦血管内皮细胞的损伤以及促炎因子的释放,降低巨噬细胞的激活和NO的分泌,发挥肝窦血管内皮的保护作用,通过离体试验初步证明了其发挥改善糖尿病AGEs沉积造成的肝损伤的作用机制。 展开更多

关键词 梓醇 糖尿病肝损伤 晚期糖基化终末产物(AGEs) GALECTIN-3 CD146 炎性损伤

在线阅读 下载PDF 职称材料