海螵蛸提取物活性成分分析及止血机制 被引量：16

1

作者 刘书豪 王有宪 +5 位作者 邵仲柏 蒋凯俊 曹联攻 李冰 沈金阳 刘玮炜 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期3366-3368,共3页

目的 分析海螵蛸提取物活性成分,并研究其止血机制。方法 以水、乙醇、石油醚为溶剂,分别采用热回流、浸泡残渣、超声处理等方法制备海螵蛸提取物。通过化学试剂反应现象判断提取物活性成分,检测提取物凝血时间、凝血四项(PT、APTT、TT... 目的 分析海螵蛸提取物活性成分,并研究其止血机制。方法 以水、乙醇、石油醚为溶剂,分别采用热回流、浸泡残渣、超声处理等方法制备海螵蛸提取物。通过化学试剂反应现象判断提取物活性成分,检测提取物凝血时间、凝血四项(PT、APTT、TT、FIB)来分析止血机制。结果 海螵蛸提取物可能含有甾体三萜、挥发油和油脂、皂苷、有机酸、内酯和香豆素、糖类、氨基酸等成分。水提物体外促凝效果最好,醇提物、石油醚提取物较弱。与空白组比较,水提物各剂量组APPT、PT缩短(P<0.05),并呈剂量依赖性。结论 海螵蛸提取物活性成分丰富,水提物具有良好的体外促凝效果,其机制可能为激活外源性凝血系统、促进内源性凝血系统中凝血因子释放酶原。 展开更多

关键词 海螵蛸 提取物 活性成分 止血机制

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限制性内切酶NcoⅠ的高效重组表达、硒代与结晶条件初步筛选 被引量：2

2

作者 程艺 马超 +5 位作者 陈晓雨 邵钰晨 王潇 杨雪丽 苏蓉 李婷婷 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期81-88,共8页

来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoⅠ是基因工程中常用的工具酶之一。然而目前NcoⅠ蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导。为了解析NcoⅠ的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获... 来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoⅠ是基因工程中常用的工具酶之一。然而目前NcoⅠ蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导。为了解析NcoⅠ的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获得了纯度>95%的NcoⅠ野生型和Se-NcoⅠ硒代蛋白。质谱分析表明,重组Se-NcoⅠ蛋白中所有硫原子成功被硒原子取代。酶切实验表明,硒代蛋白与野生型具有相似的限制酶活性。采用坐滴法筛选重组NcoⅠ蛋白结晶条件,已在3种条件下获得针状晶体,1种条件下获得颗粒状晶体。X射线衍射初步分析晶体分辨率在0.8 nm左右,为下一步解析NcoⅠ三维结构提供了基础。 展开更多

关键词 限制性内切酶 NcoⅠ 表达纯化 硒代 结晶

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一种快速精确测定Tth DNA聚合酶活性的方法

3

作者 陈晓雨 张建 +4 位作者 张新亚 唐雨婷 邵钰晨 罗志丹 卢辰 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期281-286,共6页

Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶,但在生产和改造过程中,缺乏准确、快速、简便测定酶活的方法。利用高灵敏度双链特异性核酸染料PicoGreen和特殊设计的发夹型探针,建立了一种测定Tth DNA聚合酶活性... Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶,但在生产和改造过程中,缺乏准确、快速、简便测定酶活的方法。利用高灵敏度双链特异性核酸染料PicoGreen和特殊设计的发夹型探针,建立了一种测定Tth DNA聚合酶活性的新方法。该方法的标准曲线线性关系良好,决定系数R^(2)达到0.99以上,灵敏度和准确度高,操作简单,测定结果与商业化产品标定的活力相符,经荧光定量PCR验证能够反映真实使用环境下的酶活。该方法还可推广到测定其他DNA聚合酶活性,将为DNA聚合酶的生产和改造提供有效的检测手段。 展开更多

关键词 Tth DNA聚合酶 酶活性测定 荧光染料 发夹型探针

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固定化c-ω-转氨酶催化合成(4S)-四氢萘酮

4

作者 高嵩 邵小芙 +3 位作者 果波 李前 王佩 曹阳 《精细化工》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1152-1160,共9页

以T4噬菌体衣壳为载体,探索了海绵假弧菌-ω-转氨酶(P-ω-TA)的自组装固定化,以将P-ω-TA与T4噬菌体非必需小外壳蛋白(Soc)融合的方式实现了P-ω-TA在T4噬菌体衣壳上的亲和固定及较高的位点结合数。对固定化P-ω-TA的适应性、回收性能、... 以T4噬菌体衣壳为载体,探索了海绵假弧菌-ω-转氨酶(P-ω-TA)的自组装固定化,以将P-ω-TA与T4噬菌体非必需小外壳蛋白(Soc)融合的方式实现了P-ω-TA在T4噬菌体衣壳上的亲和固定及较高的位点结合数。对固定化P-ω-TA的适应性、回收性能、(S)-型异构体选择性拆分及(1S,4S)-去甲基舍曲林的催化能力进行了测试。结果表明,固定化的P-ω-TA保持了完整的活性及适应性,可通过离心操作轻松地回收,并进行重复使用。在5次回收和重复使用过程中,每次酶活回收率均>91%,经5次催化,最终酶活保持率约为84%。固定化P-ω-TA保持了在底物手性中心处的(S)-型异构体选择性拆分以及对(1S,4S)-去甲基舍曲林的催化能力。 展开更多

关键词 海绵假弧菌-ω-转氨酶 T4噬菌体 手性拆分 酶固定化 舍曲林 精细化工中间体

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一种非奈利酮消旋体的制备方法

5

作者 曹阳 崔文慧 +2 位作者 李前 吴庆昆 高辉 《精细化工》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第11期2531-2537,共7页

以4-氰基-2-甲氧基苯甲醛和乙酰乙酸叔丁酯为原料,通过缩合、关环、氧烷基化、水解以及氨解反应,得到了非奈利酮消旋体。考察了不同取代酯在碱性条件下的水解,发现常规酯在NaOH等多种碱性条件下均未水解,而在酸性条件下则可发生水解,在... 以4-氰基-2-甲氧基苯甲醛和乙酰乙酸叔丁酯为原料,通过缩合、关环、氧烷基化、水解以及氨解反应,得到了非奈利酮消旋体。考察了不同取代酯在碱性条件下的水解,发现常规酯在NaOH等多种碱性条件下均未水解,而在酸性条件下则可发生水解,在三氟乙酸(TFA)的作用下,二氯甲烷(DCM)作溶剂,室温下可实现叔丁基4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸酯(Ⅶ)的水解,重点优化了中间体Ⅶ的水解条件。结果表明,在n(Ⅶ)∶n(TFA)=1∶10、n(Ⅶ)∶n(DCM)=1∶18、室温(25℃)条件下反应3 h,即可得到收率为68%的4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酸(Ⅷ)(HPLC纯度98%)。该法突破了常规酯在碱性条件下难以水解的困难,反应放大到百克级,最终以约35%的总收率得到非奈利酮消旋体(HPLC纯度99%)。产物经^(1)HNMR、^(13)CNMR和HRMS确定结构。 展开更多

关键词 非奈利酮 路线优化 原料药 水解反应 精细化工中间体

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固定化吡哆醇激酶催化合成磷酸吡哆醇的研究

6

作者 侯学雯 李梦磊 +2 位作者 叶蕾 邱敏 张坤晓 《食品与生物技术学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期119-126,共8页

【目的】利用镍螯合琼脂糖亲和层析介质(Ni-NTA)与组氨酸(His)标记的蛋白质特异性结合的原理,将Ni-NTA与His标记的大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)来源的吡哆醇激酶(EcpdxK)固定化,形成一种固定化式反应器,并研究吡哆醇(PN)转化为磷... 【目的】利用镍螯合琼脂糖亲和层析介质(Ni-NTA)与组氨酸(His)标记的蛋白质特异性结合的原理,将Ni-NTA与His标记的大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)来源的吡哆醇激酶(EcpdxK)固定化,形成一种固定化式反应器,并研究吡哆醇(PN)转化为磷酸吡哆醇(PNP)的最适反应条件。【方法】采用单因素分析方法探讨温度、pH、金属离子浓度和回收次数等对该催化反应的影响。【结果】固定化EcpdxK的最适反应温度为55℃,最适反应pH为5.0,最适M g2+浓度为30 mmol/L。该固定化酶在最适反应条件下,10 min内可将99%的PN转化为PNP。在采用固定化酶填充床反应器时,EcpdxK反应液柱留时间为10 min,持续反应12 h后其转化效率仍高达93%。【结论】固定化EcpdxK具有良好的温度耐受性、pH耐受性及操作稳定性,该固定化EcpdxK催化合成PNP的工艺操作简单、成本较低,具有工业化应用潜力。 展开更多

关键词 吡哆醇激酶 固定化 镍螯合琼脂糖亲和层析介质 磷酸吡哆醇

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金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增方法的建立 被引量：12

7

作者 吴华华 王锦鑫 +3 位作者 谷庆花 孙奥 司鑫鑫 董井泉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期797-801,共5页

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的金黄色葡萄球菌快速检测方法,本研究根据该菌耐热核酸酶nuc基因的保守序列,设计特异性RPA扩增引物,并经反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。结果显示:建立的金黄色葡萄球菌快速检测方法可... 为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的金黄色葡萄球菌快速检测方法,本研究根据该菌耐热核酸酶nuc基因的保守序列,设计特异性RPA扩增引物,并经反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。结果显示:建立的金黄色葡萄球菌快速检测方法可在37℃孵育35 min特异性检测金黄色葡萄球菌,而对其它病原的检测结果为阴性,特异性较强;对该菌的纯培养物和人工污染该菌的牛奶样品中的最低检出限均为10 cfu,敏感性高。利用该方法和国标培养法同时检测市场购买的牛奶样品和猪肉样品,结果显示二者检测结果一致。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高且不依赖于昂贵的仪器设备,适用于基层实验室检测。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增 快速检测 金黄色葡萄球菌

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组蛋白甲基化对酿酒酵母铁离子代谢平衡基因表达的影响 被引量：1

8

作者 张惠铭 喻勇飞 +1 位作者 卢辰 薛勇 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第6期1292-1298,共7页

为了解组蛋白化学修饰在铁离子代谢平衡相关基因表达调控中的作用,在酿酒酵母中通过敲除铁硫簇合成基因YFH1激活铁离子代谢平衡相关基因,并在此基础上敲除组蛋白甲基化酶基因,然后通过RNA测序检测组蛋白甲基化在铁离子代谢平衡相关基因... 为了解组蛋白化学修饰在铁离子代谢平衡相关基因表达调控中的作用,在酿酒酵母中通过敲除铁硫簇合成基因YFH1激活铁离子代谢平衡相关基因,并在此基础上敲除组蛋白甲基化酶基因,然后通过RNA测序检测组蛋白甲基化在铁离子代谢平衡相关基因激活中的作用。结果显示,酿酒酵母中组蛋白甲基化的缺失并没有显著影响铁离子代谢平衡通路相关基因的激活,表明组蛋白甲基化在铁离子代谢平衡基因的激活调控中并不是必须的。 展开更多

关键词 表观遗传 铁离子代谢平衡 组蛋白甲基化 酿酒酵母

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应用CRISPR/Cas9技术建立ERK激酶相分离荧光探针定点整合的稳定细胞株

9

作者 杨玉梅 张坤晓 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期159-164,共6页

旨在构建人AAVS1位点定点敲入的诱导表达型ERK-SPARK激酶荧光探针的人食管鳞癌细胞株(KYSE-150)。根据AAVS1位点的DNA序列设计和已公开ERK-SPAEK荧光探针碱基序列构建了两端带有750 bp同源臂的诱导型ERK-SPARK表达盒的同源重组供体质粒... 旨在构建人AAVS1位点定点敲入的诱导表达型ERK-SPARK激酶荧光探针的人食管鳞癌细胞株(KYSE-150)。根据AAVS1位点的DNA序列设计和已公开ERK-SPAEK荧光探针碱基序列构建了两端带有750 bp同源臂的诱导型ERK-SPARK表达盒的同源重组供体质粒。其次,利用在线设计工具设计了3个靶向AAVS1位点的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中得到3个能定点切割AAVS1位点的CRISPR/Cas9打靶载体,将同源重组供体质粒分别与表达CRISPR/Cas9打靶载体共转染KYSE-150细胞,经Dox诱导表达24 h后进行嘌呤霉素抗性筛选和流式细胞分选,得到抵抗嘌呤霉素且表达GFP的细胞亚群。再应用PCR鉴定基因型,以及Western blot检测蛋白表达。对获得的细胞群提取基因组DNA并进行PCR基因型鉴定,结果显示获得片段的大小与诱导型ERK-SPARK表达盒的大小一致。蛋白表达检测结果显示,该细胞群表达了ERK-SPARK探针融合蛋白。荧光探针成像实验结果显示,在未经Dox诱导表达条件下,细胞株有极少量泄漏表达;经Dox诱导表达后,GFP荧光蛋白在细胞质内均匀分布,无明显聚集成点现象;在加入EGF激活ERK激酶后,原本在细胞质内均匀分布的GFP绿色荧光聚集成高亮度的绿色液珠。成功获得了可诱导表达检测ERK激酶活性的SPARK荧光探针的稳定细胞株,解决了瞬时表达ERK-SPARK探针效率不稳定影响实验结果准确性的问题,为后续建立基于SPARK技术的高通量蛋白激酶抑制剂的筛选平台奠定了前期研究基础。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 AAVS1安全港 同源重组 SPARK荧光探针 稳定细胞株 KYSE-150细胞 细胞外调节蛋白激酶 表皮生长因子

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基于识别重叠序列特性的限制性内切酶的重组表达策略研究

10

作者 王睿君 龚雪梅 +3 位作者 王欣竹 叶佳琪 李梦磊 张坤晓 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期82-89,共8页

甲基转移酶可以保护宿主基因组DNA免受限制性内切酶的消化,根据这一特性,经典的限制性内切酶制备策略是首先通过表达与其配对的甲基转移酶来保护宿主菌株,然后再共表达限制性内切酶,即“一对一”的重组表达模式。作者设计了一个新的策略... 甲基转移酶可以保护宿主基因组DNA免受限制性内切酶的消化,根据这一特性,经典的限制性内切酶制备策略是首先通过表达与其配对的甲基转移酶来保护宿主菌株,然后再共表达限制性内切酶,即“一对一”的重组表达模式。作者设计了一个新的策略:通过共表达识别重叠序列的甲基转移酶来保护宿主菌株,以制备限制性内切酶。首先将识别重叠序列的甲基转移酶转入大肠杆菌ER2566,以保护宿主基因组DNA,然后将能识别重叠序列的多个限制性内切酶分别转入该宿主菌株,以进行限制性内切酶的重组表达,即“一对多”的重组表达模式。根据这一方法,利用甲基转移酶M.Esa Dix5 I、M.Alu I和M.Hha I实现了识别重叠序列(TTAA、AGCT和GCGC)的一系列限制性内切酶的重组表达,还利用甲基转移酶M.Alu I成功实现了两个新的R.Sac I同裂酶R.Eco SP4ORF25090P和R.Gma5ORF28P的重组表达。该方法简化了对抵抗限制性内切酶消化的宿主菌株的大量筛选工作,并提供了大规模制备限制性内切酶的能力。这一方法也可用于发现其他微生物中新的同工酶或同裂酶。 展开更多

关键词 限制性内切酶 甲基转移酶 重叠序列 同裂酶 同工酶

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利用连接酶检测反应检测碎片化新冠病毒S基因D614G突变

11

作者 张新亚 张建 +2 位作者 卢辰 薛勇 罗志丹 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期107-110,共4页

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S基因D614突变导致病毒感染能力显著增强,也是德尔塔变异毒株的主要来源。如何在病毒核酸检测时对此类高危SNP进行快速分型是研究者非常关注的技术问题。但新冠病毒属于单链RNA病毒,基因组易降解,现有的点突变... 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S基因D614突变导致病毒感染能力显著增强,也是德尔塔变异毒株的主要来源。如何在病毒核酸检测时对此类高危SNP进行快速分型是研究者非常关注的技术问题。但新冠病毒属于单链RNA病毒,基因组易降解,现有的点突变鉴定技术并不适用高度降解的碎片化病毒核酸。研究利用连接酶检测反应(LDR)技术结合荧光定量PCR,建立一种检测碎片化新冠病毒S基因D614G的方法。结果表明:方法对5 pmol/L的病毒RNA模板具有良好的区分度,最低可检测出长度仅为40 nt的病毒RNA所携带的点突变。 展开更多

关键词 连接酶检测反应 新冠病毒 碎片化 D614G突变

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灵杆菌胞外核酸酶在短短芽孢杆菌中的高效表达

12

作者 龚雪梅 胡艳红 +2 位作者 陈银霜 程睿婕 张坤晓 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期34-42,共9页

利用短短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)原核表达系统对灵杆菌胞外核酸酶(Serratia marcescens non-specific nuclease,SMNE)进行重组表达,以期获得高产量重组SMNE。利用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体构建SMNE重组质粒,实现其在B. c... 利用短短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)原核表达系统对灵杆菌胞外核酸酶(Serratia marcescens non-specific nuclease,SMNE)进行重组表达,以期获得高产量重组SMNE。利用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体构建SMNE重组质粒,实现其在B. choshinensis HD31-SP3菌株中的表达。通过粗酶活检测验证其活性后,首先对温度、甘油和发酵时长等发酵条件进行优化,随后将获得的重组SMNE经亲和层析、凝胶阻滞层析分离纯化后进行酶活性质表征检测。经B. choshinensis HD31-SP3菌株重组表达的SMNE,初测胞外酶活为4.07×106U/L。经发酵条件的优化测试,最终在培养基中加入终体积分数5%甘油,于30℃下摇瓶培养56 h,获得的发酵上清胞外酶活可达2.6×107U/L,是未优化条件的6倍;经蛋白质纯化条件筛选,最终经一步亲和纯化后SMNE回收产量即达30~40 mg/dL,比活力为1.3×107U/mg,为商业化对照的2~3倍。通过对该酶的酶学性质鉴定后发现:该酶最适反应条件为37~45℃,pH 8~9;在不存在Mg2+/Mn2+的情况下仍保持47%的活性,且在300 mmol/L Na+/K+条件下可保持35%~45%的活性。 展开更多

关键词 分泌表达 短短芽孢杆菌 灵杆菌胞外核酸酶

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限制性内切酶Bsa I的分离纯化与结晶及其硒代衍生物的制备

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作者 朱海 郑梦泽 +6 位作者 贾玮玮 周倩 谈帅 刘子昂 张传志 王伟玲 李婷婷 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2023年第22期110-116,共7页

目的:筛选并优化限制性内切酶Bsa I的三维结构样品制备的方法。方法:本课题采用大肠杆菌表达系统表达Bsa I蛋白及其硒代衍生物。首先构建重组表达载体pBAD-Bsa I,转化到大肠杆菌(E.coli)ER2566中进行表达,并采用亲和层析和阴离子交换层... 目的:筛选并优化限制性内切酶Bsa I的三维结构样品制备的方法。方法:本课题采用大肠杆菌表达系统表达Bsa I蛋白及其硒代衍生物。首先构建重组表达载体pBAD-Bsa I,转化到大肠杆菌(E.coli)ER2566中进行表达,并采用亲和层析和阴离子交换层析进行纯化。然后利用质谱、圆二色谱的方法测试硒代蛋白衍生情况,并对其进行酶活测定。最后采用坐滴法进行初步的晶体生长研究。结果:通过两步纯化方法获得了纯度大于90%的重组Bsa I和Se-Bsa I硒代蛋白;经质谱检测发现重组Se-Bsa I蛋白中的11个甲硫氨酸全部硒代,圆二色谱检测和酶活测试确定了硒代对Bsa I蛋白的结构和活性无明显影响。结晶实验显示重组Bsa I蛋白不仅可以在0.2 mol/L酸镁四水合物、pH6.5的0.1 mol/L二甲胂酸钠三水合物、20%聚乙二醇8000的条件下生长出颗粒状结晶,而且可以在pH4.6的0.1 mol/L三水醋酸钠、2 mol/L硫酸铵的条件下生长出球状结构晶体。结论:本研究成功实现了BsaI蛋白及其硒代蛋白的重组表达,并对蛋白晶体条件进行初筛,旨为解析BsaI蛋白三维结构提供一定的参考。 展开更多

关键词 限制性内切酶 表达纯化 硒代 结晶

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