小鼠GITRL融合蛋白的表达、纯化及免疫原性的研究 被引量：2

1

作者 马洁 王胜军 +9 位作者 毛朝明 杨敏 王锁英 许小朋 邱谷风 胡正军 姜旭淦 邵启祥 丁庆 许化溪 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期675-677,683,共4页

目的:构建含小鼠GITRL基因原核表达载体,经转化E.coli以表达GITRL融合蛋白,纯化蛋白并制备相应的抗血清。方法:将GITRL-pMD18-T重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收目的基因,与原核表达载体PET32a连接,应用电转法转化BL21(DE3)菌。阳性... 目的:构建含小鼠GITRL基因原核表达载体,经转化E.coli以表达GITRL融合蛋白,纯化蛋白并制备相应的抗血清。方法:将GITRL-pMD18-T重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收目的基因,与原核表达载体PET32a连接,应用电转法转化BL21(DE3)菌。阳性克隆经鉴定后用IPTG诱导GITRL蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE、West-ernblot进行特异性鉴定,CD4+CD25+T细胞免疫抑制试验验证其生物学功能。采用弗氏完全佐剂常规免疫方案,制备抗GITRL抗血清,抗血清的效价和特异性测定采用双向琼脂免疫扩散法。结果:经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Westernblot结果显示,在40kD处呈现单一蛋白条带,该蛋白具有阻断CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的作用,双向免疫扩散结果显示兔抗小鼠GITRL抗血清效价为1∶16。结论:成功构建GITRL原核表达质粒,制备和纯化的GITRL融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,制备并获得特异性抗血清,可用于GITRL融合蛋白生物学活性的进一步研究。 展开更多

关键词 GITRL 蛋白表达 融合蛋白 小鼠

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T-bet、GATA3及相关因子的表达与胃癌及转移的相关性研究 被引量：12

2

作者 邱谷风 王锁英 +10 位作者 王胜军 马洁 毛朝明 朱蓓 杨敏 许小朋 陈建国 胡正军 邵启祥 黄新祥 许化溪 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期798-802,共5页

目的:分析胃癌患者Th1和Th2两类细胞因子的基因表达与转录因子T-bet和GATA3表达的相关性,从细胞因子与转录因子角度考证胃癌患者Th1/Th2细胞分化趋势,探讨p53与T-bet的相关性,了解T-bet与肿瘤转移之间的关系。方法:利用荧光定量PCR技术... 目的:分析胃癌患者Th1和Th2两类细胞因子的基因表达与转录因子T-bet和GATA3表达的相关性,从细胞因子与转录因子角度考证胃癌患者Th1/Th2细胞分化趋势,探讨p53与T-bet的相关性,了解T-bet与肿瘤转移之间的关系。方法:利用荧光定量PCR技术检测55例胃癌患者及45例正常人外周血单个核细胞(PBMC)中T-bet、GATA3转录因子和IFN-γ、IL-4等细胞因子的水平,应用免疫组化法检测胃癌组织中p53的表达状况。结果:55例胃癌患者T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4的表达率依次为51%(28/55)、78%(43/55)、27%(15/55)、69%(38/55)。定量PCR结果显示,病人组的T-bet和IFN-γ明显低于正常对照组(P<0.01),而GATA3和IL-4则明显高于正常对照组(P<0.01)。T-bet与IFN-γ在病人体内的mRNA表达存在正相关性(P<0.01),正常人则没有。GATA3与IL-4的表达在两组中均呈明显正相关(P<0.01和P<0.05),且在p53阳性的患者中,T-bet的表达率较低,而GATA3的表达率较高。结论:胃癌患者有明显Th2漂移现象,且p53的表达与T-bet的表达呈负相关。 展开更多

关键词 胃癌 TH1/TH2 细胞因子 转录因子 基因表达

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T-bet基因shRNA真核表达载体的构建及其功能的初步研究 被引量：1

3

作者 薛渊 王胜军 +6 位作者 何志强 石燕 周成林 马洁 仝佳 邵启祥 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期453-455,共3页

目的:构建靶向Th1细胞特异性转录因子T-bet的小发卡结构RNA(shRNA)的真核表达载体,并评价其功能,为开展T-bet相关性疾病的免疫干预研究奠定基础。方法:设计并合成靶向T-bet的shRNA序列,构建真核表达载体,并转染DC2.4细胞;MTT法检测转染... 目的:构建靶向Th1细胞特异性转录因子T-bet的小发卡结构RNA(shRNA)的真核表达载体,并评价其功能,为开展T-bet相关性疾病的免疫干预研究奠定基础。方法:设计并合成靶向T-bet的shRNA序列,构建真核表达载体,并转染DC2.4细胞;MTT法检测转染后DC2.4细胞增殖能力,用RealtimePCR和Westernblot分别从基因及蛋白水平检测转染前后DC2.4细胞T-bet表达水平变化;RealtimePCR检测IFN-γ的mRNA;流式细胞术(FCM)检测细胞表面CD80、CD86与MHCⅡ类分子表达情况。结果:构建的T-bet靶向shRNA真核表达载体,能够显著抑制DC2.4细胞T-bet的表达,且转染后DC2.4细胞增殖受到抑制,CD80、CD86及MHCⅡ类分子表达下调,IFN-γmRNA水平显著下降。结论:成功地构建了T-betshRNA真核表达载体,转染DC2.4细胞后能有效地抑制其T-bet、IFN-γ的表达,影响其抗原提呈功能。 展开更多

关键词 T-BET 小发卡结构RNA 真核表达 树突状细胞

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转录因子Hlx修饰树突状细胞系DC2.4的功能研究

4

作者 周成林 苏兆亮 +4 位作者 朱金连 何志强 王胜军 李平 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期274-277,共4页

目的:在鼠树突状细胞系DC2.4中瞬时表达Th1特异的核转录Hlx,探讨该转录因子对树突状细胞系DC2.4的功能的影响。方法:含有Hlx基因全部编码序列的真核表达载体PIRES2-EGFP/Hlx通过脂质体转染的方法转入DC细胞,转染效率应用FACS鉴定;Hlx基... 目的:在鼠树突状细胞系DC2.4中瞬时表达Th1特异的核转录Hlx,探讨该转录因子对树突状细胞系DC2.4的功能的影响。方法:含有Hlx基因全部编码序列的真核表达载体PIRES2-EGFP/Hlx通过脂质体转染的方法转入DC细胞,转染效率应用FACS鉴定;Hlx基因在DC中表达情况应用RT-PCR和Real-time PCR检测。转染48 h后,分别从细胞因子,表面分子,吞噬功能,单向混合淋巴细胞反应方面对DC功能进行探讨。结果:真核表达载体PIRES2-EGFP/Hlx成功转入DC细胞,转染率可高达60%;在树突状细胞系DC2.4中瞬时高表达Hlx可以有效的增进成熟标志CD80,CD86,MHCII分子的表达,减弱DC的吞噬功能,IL-12表达量增加,但同时却高表达IL-10,TGF-β并表现为可抑制淋巴细胞增殖。结论:在小鼠树突状细胞系DC2.4中瞬时高表达Hlx可有效地促进DC2.4的成熟,但是在功能方面多表现为调节性DC的功能。 展开更多

关键词 IL-10 Hlx 树突状细胞 调节性DC

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T-bet对肺癌细胞系(Lewis细胞)致瘤作用的体内干预研究

5

作者 赵银霞 王楷文 +5 位作者 杨恒 郑东 苏兆亮 仝佳 王胜军 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期862-864,共3页

目的:探讨T-bet质粒局部应用对小鼠肺癌细胞皮下移植瘤的干预作用。方法:将传代培养的Lewis肺癌细胞接种于小鼠右肩部皮下,制备荷瘤小鼠模型;瘤内分别注射PIRES-eGFP/mT-bet(m指小鼠)、PIRES-eGFP质粒和PBS,观察各组小鼠存活时间,肿瘤... 目的:探讨T-bet质粒局部应用对小鼠肺癌细胞皮下移植瘤的干预作用。方法:将传代培养的Lewis肺癌细胞接种于小鼠右肩部皮下,制备荷瘤小鼠模型;瘤内分别注射PIRES-eGFP/mT-bet(m指小鼠)、PIRES-eGFP质粒和PBS,观察各组小鼠存活时间,肿瘤体积的变化;HE染色观察肿瘤组织的病理变化;Western blot检测肿瘤组织T-bet的表达,QRT-PCR检测肿瘤组织T-bet和IFN-γ的mRNA水平。结果:瘤内注射T-bet质粒载体后Western blot检测发现,肿瘤组织T-bet蛋白表达显著高于对照组;QRT-PCR结果显示,肿瘤组织T-bet和IFN-γ的mRNA水平呈上升趋势,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。T-bet质粒干预组小鼠肿瘤生长明显缓慢,存活期延长。HE染色组织病理观察可见mT-bet干预组小鼠局部组织淋巴细胞大量浸润。结论:T-bet基因局部注射可延缓小鼠肺癌Lewis皮下移植瘤的生长,提高机体的抗肿瘤免疫应答能力,增强对已发肿瘤的生长限制作用,为T-bet应用于肿瘤治疗积累试验数据。 展开更多

关键词 肺癌细胞系 mT-bet 质粒 小鼠

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急性髓系白血病患者外周血CD4^＋CD25^highFOXP3^＋调节性T细胞变化及临床意义 被引量：4

6

作者 吴朝阳 吴雅荣 +9 位作者 许化溪 王胜军 王法春 陈巧云 季勇慧 钱震 杨小飞 盛晓静 张永宁 钱军 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期591-595,600,共6页

目的:观察急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)患者外周血中调节性T细胞(Regulatory Tcells,Treg细胞)的变化,探讨其在AML发病中的作用及临床意义。方法:应用流式细胞术检测31例初诊AML患者(初诊组)、23例经化疗取得完全缓... 目的:观察急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)患者外周血中调节性T细胞(Regulatory Tcells,Treg细胞)的变化,探讨其在AML发病中的作用及临床意义。方法:应用流式细胞术检测31例初诊AML患者(初诊组)、23例经化疗取得完全缓解患者(CR组)及20例健康人群(对照组)外周血CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞、CD4+FOXP3+T细胞占CD4+细胞的比例,同时还分析了外周血CD4+/CD8+比值、NK细胞及血清乳酸脱清酶(LDH)水平。结果:与对照组相比较,AML患者初诊组及CR组外周血CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞和CD4+FOXP3+T细胞均升高(P<0.01)。与初诊组相比较,CR组CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞无显著降低(P>0.05),CD4+FOXP3+T细胞明显下降(P<0.01)。CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞的升降与CD4+FOXP3+T细胞呈正相关(r=0.86;P<0.01)。CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞及CD4+FOXP3+T细胞比例与CD4+/CD8+比值呈负相关(r分别为-0.54、-0.52;P<0.01)、与NK细胞比例呈负相关(r分别为-0.41、-0.43;P<0.05),而与LDH水平呈正相关(r分别为0.51、0.57;P<0.05)。结论:CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞增多可能是AML患者免疫功能受抑的重要原因之一,其变化对于AML的预后判断有一定的意义。CD4+FOXP3+T细胞的作用类似于CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞,其在AML疗效评价方面可能更有价值。 展开更多

关键词 T淋巴细胞 调节性 白血病 非淋巴细胞 急性 流式细胞术

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人外周血CD8^+T细胞Runx3的基因克隆及其原核表达 被引量：2

7

作者 李雅贞 王胜军 +5 位作者 石燕 戴晓莉 彭素芳 苏兆亮 邵启祥 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期107-110,共4页

目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础。方法:MACS分离外周CD8+T细胞;... 目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础。方法:MACS分离外周CD8+T细胞;采用RT-PCR方法从人外周血CD8+T细胞获得Runx3基因的cDNA,并连接pMD19-T载体导入大肠埃希菌DH5α,选择阳性克隆,应用M13F/R通用引物进行双向反应测序,以作序列鉴定。利用PCR技术从克隆载体pMD19-T/Runx3获得人Runx3的全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pQE30/Runx3;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌M15,测序鉴定后经IPTG30℃诱导4h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白并进行Western blot鉴定。结果:扩增获得的Runx3基因CDS区全长1248bp,编码415个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致。成功构建了原核表达载体pQE30/Runx3,并在工程菌M15中获得大量表达.结论:获得了人Runx3基因的克隆,并成功原核表达和制备出人Runx3融合蛋白。 展开更多

关键词 RUNX3基因 CDNA克隆 RT—PCR 原核表达

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CpG-ODN对婴幼儿喘息性支气管炎外周血单个核细胞T-bet表达的影响 被引量：2

8

作者 王锁英 许化溪 +8 位作者 杨敏 许小朋 邱谷风 李国民 张贇健 马洁 眭建 姜旭淦 胡嘉波 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1035-1039,共5页

目的:探讨CpG-ODN干预对婴幼儿喘息性支气管炎外周血单个核细胞(PBMC)T-bet表达和IFN-γ分泌的影响。方法:对28例喘息性支气管炎(喘支组)患儿于急性期和恢复期分别抽取抗凝静脉血并分离PBMC,以终浓度为10μg/ml的B型CpG-ODN刺激48小时,... 目的:探讨CpG-ODN干预对婴幼儿喘息性支气管炎外周血单个核细胞(PBMC)T-bet表达和IFN-γ分泌的影响。方法:对28例喘息性支气管炎(喘支组)患儿于急性期和恢复期分别抽取抗凝静脉血并分离PBMC,以终浓度为10μg/ml的B型CpG-ODN刺激48小时,分别应用RT-PCR和Western blot检测CpG-ODN刺激前后患儿PBMC的T-bet mRNA和蛋白表达情况,以ELISA检测PBMC培养上清IFN-γ的变化,同时设立26例健康婴儿对照组。结果:与正常对照组比较,喘支患儿PBMC表达T-bet mRNA及蛋白明显减少(P<0.05),应用CpG-ODN刺激后,两组小儿PBMC表达T-bet均显著上调,但产生IFN-γ无明显增多,对照序列ODN对T-bet表达及IFN-γ的分泌无明显影响。相关分析表明,喘支患儿T-bet mRNA与IFN-γ分泌呈正相关(r=0.57,P<0.01),CpG-ODN刺激后,二者相关性明显下降(r=0.19,P>0.05)。结论:T-bet在喘支患儿PB-MC中表达减少,提示T-bet表达缺陷参与了喘支的免疫病理,B型CpG-ODN作为一种免疫调节剂,可有效上调T-bet的表达,但不能诱导IFN-γ的产生。 展开更多

关键词 CPG-ODN 喘息 支气管炎 T-BET

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牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：3

9

作者 郑东 孔凡芝 +6 位作者 王胜军 苏兆亮 仝佳 杨恒 赵银霞 王楷文 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期572-574,共3页

目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a... 目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。 展开更多

关键词 牙龈卟啉菌 外膜蛋白RagB 原核表达 多克隆抗体

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临床分离的革兰阴性菌3类整合酶基因的筛查与Ⅰ类整合子结构分析 被引量：2

10

作者 戴晓莉 苏兆亮 +3 位作者 陈建国 彭素芳 李雅贞 许化溪 《中国感染与化疗杂志》 CAS 2009年第1期52-55,共4页

目的调查镇江地区临床分离的革兰阴性菌3类整合酶基因的检出情况,分析I类整合子-基因盒结构特征。方法对临床收集的细菌采用PCR方法、T-A克隆以及基因测序技术对3类整合酶基因以及I类整合子的结构进行分析。结果296株革兰阴性肠杆菌科... 目的调查镇江地区临床分离的革兰阴性菌3类整合酶基因的检出情况,分析I类整合子-基因盒结构特征。方法对临床收集的细菌采用PCR方法、T-A克隆以及基因测序技术对3类整合酶基因以及I类整合子的结构进行分析。结果296株革兰阴性肠杆菌科细菌和不发酵糖菌中I类整合酶基因的检出率最高为43.2%。其中在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌中的检出率分别为61.0%、14.3%、37.3%和20.0%,而Ⅱ、Ⅲ类基因的检出率较低。对I类整合子基因盒结构分析发现共检测到5种不同基因盒,分别为:dfrA17、aadA5、aadA1、aadA2、dhrfⅪ,有4种不同的基因盒排列方式。结论镇江地区临床分离的细菌I类整合子-基因盒检出率较高。 展开更多

关键词 整合子 基因盒 革兰阴性菌

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小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白生物信息学分析 被引量：1

11

作者 沈培 苏兆亮 +1 位作者 王胜军 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1205-1208,共4页

目的获取小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白（GITR）氨基酸序列,并预测其结构和功能。方法利用网络平台及相关生物学软件对小鼠GITR氨基酸序列进行生物信息学分析。结果小鼠GITR氨基酸序列与人等其他物种具有56%的同源性,... 目的获取小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白（GITR）氨基酸序列,并预测其结构和功能。方法利用网络平台及相关生物学软件对小鼠GITR氨基酸序列进行生物信息学分析。结果小鼠GITR氨基酸序列与人等其他物种具有56%的同源性,具有信号肽、胞外区、跨膜区及胞内区等结构;小鼠GITR蛋白胞外区位于第22-153号氨基酸序列区间;可能含有4个N-糖基化位点、4个丝氨酸磷酸化位点、1个苏氨酸磷酸化位点以及1个酪氨酸磷酸化位点。结论小鼠GITR氨基酸序列的生物信息学分析为进一步表达该蛋白及其相关功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 小鼠 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白 氨基酸 生物信息技术

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Hlx修饰的树突状细胞系(DC2.4/mHlx)的建立

12

作者 何志强 王胜军 +6 位作者 薛渊 石燕 柳迎照 仝佳 陈建国 邵启祥 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期285-287,290,共4页

目的:建立稳定、高表达鼠转录因子Hlx的树突状细胞系DC2.4/mHlx。方法:参照GenBank中mHlx基因序列,设计mHlxCDS全长引物;以PGEM-T/mHlx质粒为模板,通过PCR获得目的基因,再克隆到PIRES2-EGFP真核表达载体,经PCR、酶切鉴定后进行序列测定... 目的:建立稳定、高表达鼠转录因子Hlx的树突状细胞系DC2.4/mHlx。方法:参照GenBank中mHlx基因序列,设计mHlxCDS全长引物;以PGEM-T/mHlx质粒为模板,通过PCR获得目的基因,再克隆到PIRES2-EGFP真核表达载体,经PCR、酶切鉴定后进行序列测定,用脂质体转染DC2.4;应用G418筛选出耐药克隆,有限稀释法进行单克隆。通过观察EGFP的表达选定单克隆细胞株,再用流式细胞术分析、Real-time PCR和Western blot进行鉴定。结果:构建了PIRES2-mHlx-EGFP真核表达载体,并成功建立mHlx修饰和EGFP修饰的细胞系(DC2.4/mHlx和DC2.4/EGFP)。结论:成功建立稳定高表达mHlx的树突状细胞系DC2.4/mHlx,为深入探讨mHlx功能构建了平台,为Hlx修饰后的树突状细胞作为工具细胞的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 mHlx DC2.4 EGFP

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