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幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定
被引量：
4
1
作者
王文凯
钟桥
+1 位作者
谢立苹
邵世和
《中国免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第4期347-351,共5页
目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异...
目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。结果:成功扩增了cag4基因基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出pET-28a-cag4融合蛋白;优化了pET-28a-cag4原核表达体系的最适条件;Western bolt分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符;酶谱分析显示其具有明显的肽聚糖水解活性。结论:幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。
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关键词
幽门螺杆菌cag4蛋白
原核表达
纯化
融合蛋白
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职称材料
幽门螺杆菌Cag致病岛hp0527基因的缺失株构建和鉴定
被引量：
1
2
作者
母润红
邵世和
+3 位作者
钟桥
韩军
黄河
田树伟
《中国免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第10期932-935,939,共5页
目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori)Cag致病岛编码hp0527基因的突变株。为Cag致病岛致病机制及H.pylori功能研究奠定基础。方法:利用基因同源重组方法将卡那霉素抗性基因(KanR)连接到PCR扩增hp0527两端区域产生的2个目的基因片段之间,构建hp...
目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori)Cag致病岛编码hp0527基因的突变株。为Cag致病岛致病机制及H.pylori功能研究奠定基础。方法:利用基因同源重组方法将卡那霉素抗性基因(KanR)连接到PCR扩增hp0527两端区域产生的2个目的基因片段之间,构建hp0527基因缺失的自杀质粒pBlueKM40-Δhp0527;将带有卡那霉素抗性标志的缺失突变载体,通过抗生素卡那霉素筛选出缺失hp0527基因的突变株,并经PCR方法鉴定后,采用野生株和突变株的幽门螺杆菌分别与胃癌上皮细胞BGC-823共培养后,分析它们对细胞毒素相关蛋白CagA转运能力的影响。结果:成功构建出幽门螺杆菌hp0527基因突变的自杀质粒,突变载体经内切酶酶切分析显示:产生的条带与设计结果完全一致;抗生素筛选并经PCR鉴定后,获得了hp0527基因缺失株;CagA蛋白转运分析表明基因hp0527缺失前后,可以导致细菌转运CagA蛋白能力的丧失。结论:成功构建出1株缺失hp0527基因的H.pylori突变株,对于阐明该基因的功能及其在H.pylori致病中的地位及作用具有重要的研究价值。
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关键词
幽门螺杆菌
Ⅳ型分泌系统
同源重组
突变体
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职称材料
题名
幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定
被引量：
4
1
作者
王文凯
钟桥
谢立苹
邵世和
机构
江苏
大学
附属人民医院检验科
江苏大学基础医学与医学技术学院病原生物学研究室
出处
《中国免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第4期347-351,共5页
基金
国家自然科学基金项目(30870096)
江苏省高校自然科学基金项目(08KJB310001)
江苏大学临床医学科技发展基金项目(JLY20080051)资助
文摘
目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。结果:成功扩增了cag4基因基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出pET-28a-cag4融合蛋白;优化了pET-28a-cag4原核表达体系的最适条件;Western bolt分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符;酶谱分析显示其具有明显的肽聚糖水解活性。结论:幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。
关键词
幽门螺杆菌cag4蛋白
原核表达
纯化
融合蛋白
Keywords
cag4 in Helicobacter pylori； Prokaryotic expression； Purification； Fusion protein
分类号
R739.4 [医药卫生—肿瘤]
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职称材料
题名
幽门螺杆菌Cag致病岛hp0527基因的缺失株构建和鉴定
被引量：
1
2
作者
母润红
邵世和
钟桥
韩军
黄河
田树伟
机构
北华
大学
医学
检验
学院
江苏大学基础医学与医学技术学院病原生物学研究室
出处
《中国免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第10期932-935,939,共5页
基金
国家自然基金项目(30870096)
江苏省高校自然基金项目(08KJB31-0001)
文摘
目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori)Cag致病岛编码hp0527基因的突变株。为Cag致病岛致病机制及H.pylori功能研究奠定基础。方法:利用基因同源重组方法将卡那霉素抗性基因(KanR)连接到PCR扩增hp0527两端区域产生的2个目的基因片段之间,构建hp0527基因缺失的自杀质粒pBlueKM40-Δhp0527;将带有卡那霉素抗性标志的缺失突变载体,通过抗生素卡那霉素筛选出缺失hp0527基因的突变株,并经PCR方法鉴定后,采用野生株和突变株的幽门螺杆菌分别与胃癌上皮细胞BGC-823共培养后,分析它们对细胞毒素相关蛋白CagA转运能力的影响。结果:成功构建出幽门螺杆菌hp0527基因突变的自杀质粒,突变载体经内切酶酶切分析显示:产生的条带与设计结果完全一致;抗生素筛选并经PCR鉴定后,获得了hp0527基因缺失株;CagA蛋白转运分析表明基因hp0527缺失前后,可以导致细菌转运CagA蛋白能力的丧失。结论:成功构建出1株缺失hp0527基因的H.pylori突变株,对于阐明该基因的功能及其在H.pylori致病中的地位及作用具有重要的研究价值。
关键词
幽门螺杆菌
Ⅳ型分泌系统
同源重组
突变体
Keywords
Helicobacter pylori
Type IV secretion system
Allelic exchange
Mutant
分类号
R372 [医药卫生—病原生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定
王文凯
钟桥
谢立苹
邵世和
《中国免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2011
4
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
幽门螺杆菌Cag致病岛hp0527基因的缺失株构建和鉴定
母润红
邵世和
钟桥
韩军
黄河
田树伟
《中国免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2009
1
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