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CRISPR-Cas9基因编辑报道系统于dbDNA来源的iPSC AAVS1安全港的定点整合研究
1
作者
何佳佳
陈耀
+2 位作者
曹淳
鞠小丽
周小明
《华中科技大学学报(医学版)》
北大核心
2025年第2期151-158,共8页
目的建立简便的doggybone DNA(dbDNA)制备技术路线,探讨dbDNA与传统质粒DNA基因表达与诱导免疫反应的差异;利用dbDNA诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent ste...
目的建立简便的doggybone DNA(dbDNA)制备技术路线,探讨dbDNA与传统质粒DNA基因表达与诱导免疫反应的差异;利用dbDNA诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC);探索在iPSC AAVS1位点插入超长DNA片段的方案,并同时将Cas9表达框定点插入dbDNA来源的iPSC腺相关病毒位点1(adeno-associated virus site 1,AAVS1)安全港内,构建仅需输入目的基因靶向单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)即可实现iPSC基因编辑的稳定细胞株。方法利用Phi29 DNA聚合酶多重置换扩增、原核端粒酶TelN酶切及共价连接、限制性内切酶和外切酶去除骨架环,从而建立简便的dbDNA制备技术路线,将dbDNA-GFP载体与pMax-dbDNA-GFP传统质粒载体分别电转至PBMC,检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达效率,利用qPCR检测两组细胞干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的mRNA表达水平;制备dbDNA重编程载体dbDNA-MOS、dbDNA-KLF4、dbDNA-MYC及dbDNA-BCL并核转PBMC诱导重编程,通过形态学、碱性磷酸酶染色、RT-PCR以及干细胞多能性标志物检测来鉴定dbDNA-iPSC细胞系;在iPSC AAVS1位点利用ZFN与TALEN基因编辑技术插入11.5 kb的含有Cas9表达框、序列中引入终止密码子的EGFP读码框、真核细胞筛选标记等元件的超长DNA片段,通过红色荧光检测、基因组PCR反应以及Western blot等方法鉴定Cas9整合入AAVS1位点的iPSC细胞株,将EGFP单链同源修复模板与EGFP sgRNA共转染阳性iPSC细胞株,靶向修复EGFP基因中错误终止密码子,正确表达绿色荧光蛋白,从而验证Cas9蛋白的基因编辑能力。结果成功制备dbDNA载体并利用其实现基因表达,dbDNA表达GFP基因效率与传统质粒DNA表达效率相近,IFN-γ的mRNA表达水平dbDNA组小于传统质粒DNA组;成功获取形态似人胚胎干细胞,碱性磷酸酶染色、多能性相关基因表达及干细胞多能性标志物阳性的iPSC细胞系;并在该细胞系安全港AAVS1位点成功基因编辑插入超长片段CRISPR-Cas9基因编辑报道系统,基因组PCR鉴定整合片段成功插入基因组,表达红色荧光蛋白,Western blot证实Cas9蛋白成功表达,并成功修复EGFP基因,使细胞表达绿色荧光。结论本研究成功建立了简便的dbDNA制备的技术路线,dbDNA载体基因表达效率与传统质粒DNA无差异,诱导免疫反应较小;经形态学、碱性磷酸酶染色、RT-PCR以及干细胞多能性标志物鉴定获取dbDNA来源的iPSC;成功在iPSC AAVS1安全港插入一个11.5 kb的超长DNA片段,构建Cas9介导基因编辑的iPSC稳定细胞株。
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关键词
诱导性多能干细胞
dbDNA
CRISPR-Cas9
腺相关病毒位点1
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职称材料
营养和氧的感应及信号转导
2
作者
王金玉
周小明
《华中科技大学学报(医学版)》
北大核心
2025年第2期283-289,共7页
营养感应是近年来生命科学关注的热点领域,产生了一系列原创性的研究成果,极大地拓展了科学界对分子营养科学的认识。营养稳态对人类健康至关重要,本篇综述结合近年来科学界对营养感应研究的最新成果,简述了葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、胆...
营养感应是近年来生命科学关注的热点领域,产生了一系列原创性的研究成果,极大地拓展了科学界对分子营养科学的认识。营养稳态对人类健康至关重要,本篇综述结合近年来科学界对营养感应研究的最新成果,简述了葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、胆固醇等生命必需营养物质和氧的感应过程及其与人类疾病的密切关系。
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关键词
营养感应
MTOR
信号转导
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职称材料
纵向分层应变技术评估蒽环类药物化疗后乳腺癌患者左心收缩功能
被引量：
9
3
作者
马勇
金洁
+1 位作者
陈勇
杨菲
《中国医学影像技术》
CSCD
北大核心
2017年第5期708-712,共5页
目的应用二维分层应变技术评估蒽环类药物化疗后乳腺癌患者早期左心室收缩功能的变化。方法收集接受蒽环类药物化疗的乳腺癌患者32例及未接受化疗的乳腺癌术后患者20例。化疗患者于化疗3个月、5个月后接受常规超声心动图采集图像,应用Ec...
目的应用二维分层应变技术评估蒽环类药物化疗后乳腺癌患者早期左心室收缩功能的变化。方法收集接受蒽环类药物化疗的乳腺癌患者32例及未接受化疗的乳腺癌术后患者20例。化疗患者于化疗3个月、5个月后接受常规超声心动图采集图像,应用EchoPAC软件测量左心室长轴各切面收缩期心内膜下、中层和心外膜下心肌的整体纵向应变(GLS)及各节段(基底段、中间段、心尖段)的纵向应变。结果与对照组比较,随着化疗周期的增加,蒽环类药物化疗后乳腺癌患者心内膜下、中层和心外膜下心肌GLS均减低(P均<0.05),而左心室射血分数(LVEF)无显著差异(P>0.05);与对照组比较,除各层心肌心尖段外,化疗后患者各层心肌基底段、中间段纵向应变减低(P均<0.05)。结论纵向分层应变技术可准确评估乳腺癌蒽环类药物化疗后左心各层心肌整体及局部收缩功能,为判断心肌损伤程度提供了新的方法。
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关键词
乳腺肿瘤
化学疗法
辅助
超声心动描记术
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职称材料
题名
CRISPR-Cas9基因编辑报道系统于dbDNA来源的iPSC AAVS1安全港的定点整合研究
1
作者
何佳佳
陈耀
曹淳
鞠小丽
周小明
机构
江苏大学医学院基础医学系
依诺赞(
江苏
)生物科技有限公司
出处
《华中科技大学学报(医学版)》
北大核心
2025年第2期151-158,共8页
基金
国家自然科学基金资助项目(No.81571546)。
文摘
目的建立简便的doggybone DNA(dbDNA)制备技术路线,探讨dbDNA与传统质粒DNA基因表达与诱导免疫反应的差异;利用dbDNA诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC);探索在iPSC AAVS1位点插入超长DNA片段的方案,并同时将Cas9表达框定点插入dbDNA来源的iPSC腺相关病毒位点1(adeno-associated virus site 1,AAVS1)安全港内,构建仅需输入目的基因靶向单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)即可实现iPSC基因编辑的稳定细胞株。方法利用Phi29 DNA聚合酶多重置换扩增、原核端粒酶TelN酶切及共价连接、限制性内切酶和外切酶去除骨架环,从而建立简便的dbDNA制备技术路线,将dbDNA-GFP载体与pMax-dbDNA-GFP传统质粒载体分别电转至PBMC,检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达效率,利用qPCR检测两组细胞干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的mRNA表达水平;制备dbDNA重编程载体dbDNA-MOS、dbDNA-KLF4、dbDNA-MYC及dbDNA-BCL并核转PBMC诱导重编程,通过形态学、碱性磷酸酶染色、RT-PCR以及干细胞多能性标志物检测来鉴定dbDNA-iPSC细胞系;在iPSC AAVS1位点利用ZFN与TALEN基因编辑技术插入11.5 kb的含有Cas9表达框、序列中引入终止密码子的EGFP读码框、真核细胞筛选标记等元件的超长DNA片段,通过红色荧光检测、基因组PCR反应以及Western blot等方法鉴定Cas9整合入AAVS1位点的iPSC细胞株,将EGFP单链同源修复模板与EGFP sgRNA共转染阳性iPSC细胞株,靶向修复EGFP基因中错误终止密码子,正确表达绿色荧光蛋白,从而验证Cas9蛋白的基因编辑能力。结果成功制备dbDNA载体并利用其实现基因表达,dbDNA表达GFP基因效率与传统质粒DNA表达效率相近,IFN-γ的mRNA表达水平dbDNA组小于传统质粒DNA组;成功获取形态似人胚胎干细胞,碱性磷酸酶染色、多能性相关基因表达及干细胞多能性标志物阳性的iPSC细胞系;并在该细胞系安全港AAVS1位点成功基因编辑插入超长片段CRISPR-Cas9基因编辑报道系统,基因组PCR鉴定整合片段成功插入基因组,表达红色荧光蛋白,Western blot证实Cas9蛋白成功表达,并成功修复EGFP基因,使细胞表达绿色荧光。结论本研究成功建立了简便的dbDNA制备的技术路线,dbDNA载体基因表达效率与传统质粒DNA无差异,诱导免疫反应较小;经形态学、碱性磷酸酶染色、RT-PCR以及干细胞多能性标志物鉴定获取dbDNA来源的iPSC;成功在iPSC AAVS1安全港插入一个11.5 kb的超长DNA片段,构建Cas9介导基因编辑的iPSC稳定细胞株。
关键词
诱导性多能干细胞
dbDNA
CRISPR-Cas9
腺相关病毒位点1
Keywords
induced pluripotent stem cell
doggybone DNA
CRISPR-Cas9
adeno-associated virus site 1
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
营养和氧的感应及信号转导
2
作者
王金玉
周小明
机构
江苏大学医学院基础医学系
出处
《华中科技大学学报(医学版)》
北大核心
2025年第2期283-289,共7页
基金
国家自然科学基金资助项目(No.81571546)。
文摘
营养感应是近年来生命科学关注的热点领域,产生了一系列原创性的研究成果,极大地拓展了科学界对分子营养科学的认识。营养稳态对人类健康至关重要,本篇综述结合近年来科学界对营养感应研究的最新成果,简述了葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、胆固醇等生命必需营养物质和氧的感应过程及其与人类疾病的密切关系。
关键词
营养感应
MTOR
信号转导
Keywords
nutrition sensing
mTOR
signal transduction
分类号
R151.2 [医药卫生—营养与食品卫生学]
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职称材料
题名
纵向分层应变技术评估蒽环类药物化疗后乳腺癌患者左心收缩功能
被引量：
9
3
作者
马勇
金洁
陈勇
杨菲
机构
江苏大学医学院基础医学系
出处
《中国医学影像技术》
CSCD
北大核心
2017年第5期708-712,共5页
文摘
目的应用二维分层应变技术评估蒽环类药物化疗后乳腺癌患者早期左心室收缩功能的变化。方法收集接受蒽环类药物化疗的乳腺癌患者32例及未接受化疗的乳腺癌术后患者20例。化疗患者于化疗3个月、5个月后接受常规超声心动图采集图像,应用EchoPAC软件测量左心室长轴各切面收缩期心内膜下、中层和心外膜下心肌的整体纵向应变(GLS)及各节段(基底段、中间段、心尖段)的纵向应变。结果与对照组比较,随着化疗周期的增加,蒽环类药物化疗后乳腺癌患者心内膜下、中层和心外膜下心肌GLS均减低(P均<0.05),而左心室射血分数(LVEF)无显著差异(P>0.05);与对照组比较,除各层心肌心尖段外,化疗后患者各层心肌基底段、中间段纵向应变减低(P均<0.05)。结论纵向分层应变技术可准确评估乳腺癌蒽环类药物化疗后左心各层心肌整体及局部收缩功能,为判断心肌损伤程度提供了新的方法。
关键词
乳腺肿瘤
化学疗法
辅助
超声心动描记术
Keywords
Breast neoplasms
Chemotherapy
adjuvant
Echocardiography
分类号
R540.45 [医药卫生—心血管疾病]
R737.9 [医药卫生—肿瘤]
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题名
作者
出处
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被引量
操作
1
CRISPR-Cas9基因编辑报道系统于dbDNA来源的iPSC AAVS1安全港的定点整合研究
何佳佳
陈耀
曹淳
鞠小丽
周小明
《华中科技大学学报(医学版)》
北大核心
2025
0
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下载PDF
职称材料
2
营养和氧的感应及信号转导
王金玉
周小明
《华中科技大学学报(医学版)》
北大核心
2025
0
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下载PDF
职称材料
3
纵向分层应变技术评估蒽环类药物化疗后乳腺癌患者左心收缩功能
马勇
金洁
陈勇
杨菲
《中国医学影像技术》
CSCD
北大核心
2017
9
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