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小鼠FoxP3基因腺相关病毒的制备与鉴定 被引量:2
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作者 王胜军 马洁 +5 位作者 马斌 毛朝明 仝佳 杨敏 邵启祥 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期731-733,736,共4页
目的:构建携带小鼠FoxP3基因的重组腺相关病毒,并检测其在NIH3T3细胞的表达情况。方法:将FoxP3通过内部核糖体进入位点(IRES)与报告基因增强型绿色荧光蛋白连接,构建同时含有目的基因和报告基因的重组腺相关病毒(rAAV)表达质粒,通过磷... 目的:构建携带小鼠FoxP3基因的重组腺相关病毒,并检测其在NIH3T3细胞的表达情况。方法:将FoxP3通过内部核糖体进入位点(IRES)与报告基因增强型绿色荧光蛋白连接,构建同时含有目的基因和报告基因的重组腺相关病毒(rAAV)表达质粒,通过磷酸钙沉淀法共转染HEK293细胞,收获并通过肝素亲和层析法纯化病毒,并对病毒纯度和滴度进行鉴定。利用携带FoxP3基因的重组病毒体外感染小鼠NIH3T3细胞,体外观察感染效率和目的基因转录情况。结果:包装成功的rAAV/FoxP3经纯化后获得了高纯度的rAAV/FoxP3,实时定量PCR检测rAAV/FoxP3的病毒滴度达到5.0×1012vg/mL,体外感染NIH3T3细胞,流式细胞术测定感染效率可达92.88%,实时PCR测定细胞内存在高水平FoxP3mRNA。结论:获得携带FoxP3-IRES-EGFP的rAAV,并可有效感染NIH3T3细胞,为进一步研究FoxP3的生物学功能提供了有效工具。 展开更多
关键词 FOXP3 腺相关病毒 免疫调节
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人GITR_(aa27-165)蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备 被引量:2
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作者 仝佳 王胜军 +6 位作者 陈君 毛朝明 杨云良 杨敏 胡正军 只棣媛 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期243-246,共4页
目的:表达和纯化人GITR胞外段(hGITRaa27-165)融合蛋白,制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb)。方法:利用PCR从pGEMT-hGITR获得hGITRaa27-165编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-hGITRaa27-165... 目的:表达和纯化人GITR胞外段(hGITRaa27-165)融合蛋白,制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb)。方法:利用PCR从pGEMT-hGITR获得hGITRaa27-165编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-hGITRaa27-165;将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,通过Profinity IMACNi-Charged Resin亲和层析柱进行纯化;纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性。结果:构建了pQE30-hGITRaa27-165原核表达载体,原核蛋白hGI-TRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGITRaa27-165蛋白,蛋白浓度为400mg/L,制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达1∶1.6×105,Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论:获得高纯度hGITRaa27-165蛋白,并制备特异性pAb,将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础。 展开更多
关键词 hGITR 原核表达 多克隆抗体
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人UL16结合蛋白3的原核表达及其多克隆抗体制备 被引量:4
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作者 秦伟 毛朝明 +4 位作者 王胜军 吴蔚 牟笑 许化溪 包丹霞 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期520-523,共4页
目的:表达和纯化人UL16结合蛋白3(ULBP3)胞外段融合蛋白,制备兔抗人ULBP3多克隆抗体。方法:利用PCR技术获得人ULBP3分子胞外段的基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建出重组表达质粒pQE30-ULBP3(aa30-171)。测序鉴定正确... 目的:表达和纯化人UL16结合蛋白3(ULBP3)胞外段融合蛋白,制备兔抗人ULBP3多克隆抗体。方法:利用PCR技术获得人ULBP3分子胞外段的基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建出重组表达质粒pQE30-ULBP3(aa30-171)。测序鉴定正确后转化入大肠杆菌感受态细胞M15,经IPTG 30℃诱导4 h后,SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在。用镍柱对融合蛋白进行纯化,将纯化的蛋白免疫新西兰白兔,采用流式细胞术(FCM)、Western blot法和免疫组化染色对所得多克隆抗体的生物学特性进行鉴定。结果:成功表达及纯化了人ULBP3(aa30-171)重组蛋白。结果显示该多克隆抗体能够识别大肠癌细胞株COLO205表面表达的天然构象ULBP3分子,而且能与结直肠癌组织细胞的ULBP3分子结合。结论:成功构建了原核表达载体pQE30-ULBP3(aa30-171),并获得高纯度的人pQE30-ULBP3(aa30-171)重组蛋白;成功制备了兔抗人ULBP3分子的多克隆抗体。 展开更多
关键词 ULBP3 NKG2D 多克隆抗体
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