江苏及周边地区鸭致病性大肠杆菌血清型、毒力因子及耐药研究 被引量：12

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作者 郭长明 吴植 +6 位作者 朱善元 王永娟 封琦 董洪燕 袁橙 徐海 吴双 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第12期4076-4084,共9页

本研究旨在明确江苏及周边地区鸭禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的血清型、毒力基因分布和耐药性之间的相关性,以期为APEC的防控提供依据。从江苏省及周边养鸭场分离了191株APEC,并对其中21株(每个养殖场选... 本研究旨在明确江苏及周边地区鸭禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的血清型、毒力基因分布和耐药性之间的相关性,以期为APEC的防控提供依据。从江苏省及周边养鸭场分离了191株APEC,并对其中21株(每个养殖场选取1株)的O抗原血清型、毒力基因分布和耐药性进行检测。对21株APEC的血清型检测结果表明,O65血清型12株,占全部菌株的57.14%,O5、O28、O42、O87、O93、O138、O147血清型均为1株,其他血清型2株;毒力基因检测结果表明,5个毒力基因有较高的分布率,其中fimA基因的阳性率为100%,ECs3737、ECs3703、tsh和irp2基因的阳性率分别为90.5%、85.7%、57.1%和42.9%,含有5个毒力基因的菌株共有6株(28.57%);药敏试验结果表明,21株APEC均存在多重耐药性,100%的分离菌株对恩诺沙星、强力霉素、万古霉素和红霉素耐药,85.71%的分离株对10种以上抗生素耐药,14.29%的菌株对21种药物都耐药;对血清型、毒力基因分布和耐药性之间的关系分析表明,含有4种以上毒力基因的菌株有13株,其中9株是O65血清型。在13株含有4种以上毒力基因的菌株中,耐15种药物以上的有9株(69.23%),耐20种以上药物的有3株(23.08%),表明含有4种以上毒力基因的菌株多重耐药现象严重。研究表明,江苏及周边地区鸭源大肠杆菌血清型复杂,携带多种毒力基因,耐药性严重。 展开更多

关键词 禽致病性大肠杆菌 血清型 毒力基因 耐药性

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一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立

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作者 贾文凤 蒋香香 +3 位作者 陶慧丽 王安平 吴植 朱善元 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期298-309,共12页

[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其... [目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。 展开更多

关键词 鸭肠炎病毒 CRISPR/Cas9基因编辑 重组载体

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广西某猪场猪链球菌分离鉴定及其生物学特性研究 被引量：9

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作者 郭长明 陈怀君 +4 位作者 朱善元 袁敬知 葛强 李珣 王晓晔 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第2期736-746,共11页

2019年12月广西玉林某猪场猪连续发生多起保育猪突然死亡病例,为确诊该猪场猪发病死亡原因并调查分离菌株的致病性与耐药情况,对发病猪场进行采样和细菌分离培养,并对分离菌株进行形态学观察、生化鉴定、gdh基因PCR扩增、血清型和7个毒... 2019年12月广西玉林某猪场猪连续发生多起保育猪突然死亡病例,为确诊该猪场猪发病死亡原因并调查分离菌株的致病性与耐药情况,对发病猪场进行采样和细菌分离培养,并对分离菌株进行形态学观察、生化鉴定、gdh基因PCR扩增、血清型和7个毒力基因的鉴定、耐药性检测以及耐药基因的鉴定。结果显示,从两头病死猪中各分离出1株细菌,在TSB固体培养基表面培养为灰白色、表面光滑、边缘整齐且大小一致的圆形菌落,初步鉴定为革兰阳性链球菌,分别命名为GXYL-F1、GXYL-N2。经猪链球菌特异性基因gdh及血清型引物鉴定,两分离株均为9型猪链球菌。生化鉴定结果显示,两分离菌株均可发酵水杨素、麦芽糖、M.R.和七叶苷。PCR检测菌株的毒力基因结果显示,gdh、fbps、sao、sbp2’和orf2均为阳性,mrp、epf、sly基因均为阴性。药敏试验结果显示,两分离株均对新霉素、链霉素、替米考星、泰乐菌素、红霉素、四环素、左氧氟沙星、青霉素和磺胺嘧啶这9种药物呈耐药性,此外分离菌株GXYL-F1还对恩诺沙星耐药。两分离菌株均扩增出耐药基因aadA1、qnrB、qnrS。表明该猪场保育猪突然死亡是由9型猪链球菌引起。上述研究结果为该猪场制定9型猪链球菌防治措施提供参考依据,并为了解猪链球菌流行血清型多样性与防控技术研究提供了新的数据。 展开更多

关键词 猪 猪链球菌 PCR鉴定 耐药性 毒力基因 药敏试验

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海南罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及生物学特性研究 被引量：9

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作者 陈怀君 郭长明 +6 位作者 朱善元 吴植 袁圣 王永娟 袁橙 潘勇 王晓晔 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第8期3058-3068,共11页

为探究目前海南地区罗非鱼无乳链球菌病的流行性,了解该地区无乳链球菌耐药情况,本研究2020年8月从海南地区部分渔业养殖场的病鱼中共分离获得15株无乳链球菌,对各分离菌株的血清型、主要毒力基因及耐药性进行检测,并对多重耐药情况进... 为探究目前海南地区罗非鱼无乳链球菌病的流行性,了解该地区无乳链球菌耐药情况,本研究2020年8月从海南地区部分渔业养殖场的病鱼中共分离获得15株无乳链球菌,对各分离菌株的血清型、主要毒力基因及耐药性进行检测,并对多重耐药情况进行分析。血清型检测结果显示,15株分离菌株的血清型与对照菌株A909一致,均为Ⅰa型。毒力基因检测结果显示,15株分离菌株均未检出毒力基因scpB,但该毒力基因在参考菌株人源无乳链球菌2603V/R中检出,而主要毒力基因cylE、sodA、gapC的检出率均为100%。药敏试验结果表明,15株分离菌株对甲氧胺嘧啶、磺胺异噁唑、复方新诺明、链霉素、新霉素、庆大霉素的耐药率达85%以上;对头孢克洛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢拉定、卡那霉素、红霉素、利福平、克林霉素敏感性达80%以上;未发现对甲氧胺嘧啶、氟罗沙星、链霉素、新霉素、庆大霉素敏感的菌株。多重耐药检测结果表明,15株分离菌株均至少对4种药物表现耐药,其中6重及以上耐药的菌株占总分离菌株数的86.67%,并有2株为13重耐药菌株。本研究为海南地区鱼源无乳链球菌病的用药提供参考,为华南地区罗非鱼无乳链球菌的流行病学和疾病防控提供调查依据。 展开更多

关键词 鱼源无乳链球菌 血清型 毒力基因 多重耐药

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龙胆草及其提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究 被引量：10

5

作者 刘云 朱善元 +3 位作者 龚祝南 秦枫 顾玲玲 吴晓洁 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第11期3449-3456,共8页

为研究龙胆草水提取物、龙胆草总黄酮、龙胆草总苷体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用,本试验建立Marc-145细胞模型,在研究其对Marc-145细胞最大安全浓度的基础上,结合细胞病变形态观察和MTT法,设立药物组、利巴韦林阳性对照组... 为研究龙胆草水提取物、龙胆草总黄酮、龙胆草总苷体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用,本试验建立Marc-145细胞模型,在研究其对Marc-145细胞最大安全浓度的基础上,结合细胞病变形态观察和MTT法,设立药物组、利巴韦林阳性对照组、病毒对照组和细胞对照组,对病毒进行阻断、抑制和直接灭活3种作用方式的测定。结果显示,龙胆草水提取物、龙胆草总黄酮、龙胆草总苷和利巴韦林的最大安全浓度分别为6.250、0.020、0.630和0.016 mg/mL。在体外抗PRRSV作用的试验中,龙胆草水提取物对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为43.1%、57.4%和56.4%,均低于阳性对照利巴韦林,且各作用方式下细胞均发生了明显病变。龙胆草总黄酮对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为66.1%、41.1%和42.7%,其抑制作用和直接灭活作用的抑制率均低于阳性对照利巴韦林,阻断作用下细胞轻微病变。龙胆草总苷对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为33.4%、78.2%和81.9%,其抑制和直接灭活作用较强,远高于阳性对照利巴韦林,且在这两种作用方式下细胞基本保持单层完好。综合3种作用方式,3种龙胆草提取物中龙胆草总苷抗PRRSV的效果最好,其次是龙胆草水提取物和龙胆草总黄酮。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 细胞病变 抗病毒活性 龙胆草

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中药复方对大肠杆菌感染雏鸭的防治效果研究 被引量：7

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作者 秦枫 刘云 +5 位作者 吴植 封琦 吴双 宋海港 吴晓洁 朱善元 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第10期3371-3378,共8页

本研究对由地锦草、石榴皮等组成的中药复方对大肠杆菌感染雏鸭的临床治疗效果进行了研究,旨在为临床大肠杆菌感染提供新的治疗手段。试验选取50只健康1日龄雏鸭,随机分为5组,每组10只。试验组分别为空白对照组、模型组、阿莫西林组、... 本研究对由地锦草、石榴皮等组成的中药复方对大肠杆菌感染雏鸭的临床治疗效果进行了研究,旨在为临床大肠杆菌感染提供新的治疗手段。试验选取50只健康1日龄雏鸭,随机分为5组,每组10只。试验组分别为空白对照组、模型组、阿莫西林组、中药复方高剂量组(DSH)和低剂量组(DSL)。给药组在3日龄开始给药,连续给药至试验结束,共10 d。除空白对照组外,在雏鸭6日龄时用大肠杆菌腹腔注射进行攻毒,0.5 mL/只。比较各试验组雏鸭的病死率;对病死鸭和各组存活鸭进行解剖,观察肝脏和小肠的病理剖检及HE染色切片;检测血常规及血清生化各项指标,评价中药复方对感染大肠杆菌雏鸭的治疗效果。结果显示,DSH、DSL和阿莫西林均能够有效降低感染雏鸭的死亡率;与模型组相比,阿莫西林和DSH、DSL组均可减少肝脏、小肠等器官的损伤。与空白对照组相比,模型组的谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)显著升高(P<0.05),碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素(UREA)极显著升高(P<0.01),且模型组和给药组血液中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)等指标变化显著(P<0.05)。与模型组相比,给药组ALP显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01),血液中WBC、RBC、HGB、PLT等指标极显著升高(P<0.01),说明给药组机体损伤程度低于模型组。以上结果表明,中药复方可以减轻因大肠杆菌所引起的机体损伤,且作用效果与阿莫西林相近。 展开更多

关键词 大肠杆菌 雏鸭 体内 中药 治疗效果

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广西罗非鱼无乳链球菌的分离鉴定、毒力基因及耐药性研究 被引量：12

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作者 郭长明 陈怀君 +5 位作者 袁橙 罗福广 黄德生 贾国华 袁圣 朱善元 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第7期2607-2616,共10页

本研究旨在明确中国罗非鱼主养区广西各地罗非鱼无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)分离株的血清型分布、毒力基因携带情况和耐药情况,为罗非鱼无乳链球菌病的防控奠定基础。2018-2019年从广西柳州、钦州、南宁、北海等地患无乳链球... 本研究旨在明确中国罗非鱼主养区广西各地罗非鱼无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)分离株的血清型分布、毒力基因携带情况和耐药情况,为罗非鱼无乳链球菌病的防控奠定基础。2018-2019年从广西柳州、钦州、南宁、北海等地患无乳链球菌病罗非鱼体内分离了47株无乳链球菌,并对各分离株的血清型、毒力基因分布和耐药情况进行检测和分析。血清型检测结果表明,47株无乳链球菌血清型高度一致,均为Ⅰa血清型。对4种毒力基因检测结果表明,47株无乳链球菌临床分离株cylE、sodA、gapC毒力基因的检出率均为100%,而scpB基因仅在人源参考菌株2603V/R中检出,在所有鱼源分离株中未检出。对11类(31种)常见抗生素的药敏试验结果表明,临床分离株对磺胺异噁唑、新霉素、庆大霉素、卡那霉素的耐药率达到90%以上,对氧氟沙星、左氧氟沙星、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢克洛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢拉定、土霉素、强力霉素的敏感性均为100%。多重耐药检测结果表明,5重以上耐药菌株占93.62%,其中9重以上耐药菌株为19.15%,且均分离自柳州地区。结果表明,广西地区罗非鱼源无乳链球菌血清型单一,均为Ⅰa血清型,且均携带多种毒力基因,多重耐药现象严重。 展开更多

关键词 无乳链球菌 罗非鱼 血清型 毒力基因 耐药性

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无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究 被引量：3

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作者 郭长明 吴植 +5 位作者 吴双 王永娟 王安平 刘广锦 刘永杰 朱善元 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第9期2507-2515,共9页

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001(登录号:NC_018646)目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融... 为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001(登录号:NC_018646)目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD 50为5.68×10 4 CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。 展开更多

关键词 无乳链球菌 dnaJ基因 基因缺失株 毒力

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替米考星颗粒在猪体内的药代动力学研究 被引量：5

9

作者 封琦 张笑意 +2 位作者 吴植 郭长明 朱善元 《中国兽药杂志》 2019年第4期59-64,共6页

研究20%树脂包被替米考星颗粒在猪体内的药代动力学特性并评价其(受试制剂T)与国际(R1)国内(R2)两种参比制剂的生物等效性。采用随机三制剂、三周期自身交叉试验设计,选取6头健康的阉割过的小公猪(体重20.7±2.6 kg),分别口灌给药... 研究20%树脂包被替米考星颗粒在猪体内的药代动力学特性并评价其(受试制剂T)与国际(R1)国内(R2)两种参比制剂的生物等效性。采用随机三制剂、三周期自身交叉试验设计,选取6头健康的阉割过的小公猪(体重20.7±2.6 kg),分别口灌给药三种制剂(10 mg/kg b.w.),采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆替米考星浓度,利用Kinetica 5.0分析药代动力学特性及生物等效性评价。20%树脂包被替米考星颗粒在猪体内的药时曲线符合带一级吸收的二室开放模型;T、R1、R2的C_(max)分别为(0.2830±0.0292)、(0.2815±0.0291)、(0.4087±0.0421)μg/mL,t_(max)分别为(4±0.9832)、(0.75±0.1581)、(1±0.2458)h,AUC_(0-∞)分别为(10.8715±1.1203)、(9.8715±1.0173)、(10.6441±1.096 9)μg·h·mL^(-1);受试制剂相比于两种参比制剂的相对生物利用度分别为110.13±6.04%(R1)和102.63±9.64%(R2)。结果表明,三种制剂间具备生物等效性;20%树脂包被替米考星颗粒有更好的缓释作用,具有一定的生物安全性,在体内保持药效时间更久。 展开更多

关键词 替米考星 高效液相色谱法 猪 药代动力学 生物等效性

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猪流行性腹泻病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体制备

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作者 吴婕 杜菁 +8 位作者 樊繁 任金阳 卢会鹏 张力 雷昕诺 曹世诺 吴植 朱睿 朱善元 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4522-4530,共9页

【目的】利用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)核衣壳蛋白(N),并制备具有高效价和特异性强的多克隆抗体。【方法】利用生物信息学工具分析PEDV N蛋白氨基酸序列,并预测其抗原性;利用原核表达载... 【目的】利用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)核衣壳蛋白(N),并制备具有高效价和特异性强的多克隆抗体。【方法】利用生物信息学工具分析PEDV N蛋白氨基酸序列,并预测其抗原性;利用原核表达载体pColdⅠ诱导表达重组N蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用兔多抗制备佐剂与纯化后的重组N蛋白混合后免疫新西兰白兔,收集血清制备多克隆抗体。利用间接ELISA法测定重组N蛋白多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】生物信息学预测结果显示,N蛋白不含信号肽和跨膜结构,具有良好的抗原性和溶解度。SDS-PAGE电泳结果显示,重组N蛋白大小约为58 ku,主要以可溶性蛋白存在;Western blotting结果显示,该蛋白能与抗His标签的鼠源单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA结果显示,多克隆抗体效价可达1∶204800;Western blotting结果表明,抗体稀释度为1∶5000时能特异性识别重组N蛋白及PEDV感染后的Vero细胞样品中的N蛋白;IFA结果显示,当稀释度为1∶1000时,该抗体能有效识别PEDV感染细胞样品中的N蛋白。【结论】本研究成功制备了效价高和特异性好的兔抗N蛋白多克隆抗体,为深入研究PEDV N蛋白的功能、了解PEDV复制机制和病毒-宿主细胞间的互作提供试验材料,为开发PEDV诊断和检测方法奠定基础。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白 原核表达 多克隆抗体

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鸭坦布苏病毒可视化RT-LAMP快速检测方法的建立与初步应用 被引量：9

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作者 吴植 夏文龙 +3 位作者 蔡树东 郭长明 袁维峰 王永娟 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第11期3334-3339,共6页

为实现鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,... 为实现鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;该方法灵敏度是常规RT-PCR的100倍;只能特异性扩增坦布苏病毒,对于其他常见的禽源病毒无特异性扩增;检测结果可直接通过肉眼观察来判断;对临床74份疑似病料,可检出65份。本试验建立的方法灵敏性高、特异性强,可用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断和流行病学调查。 展开更多

关键词 鸭坦布苏病毒(DTMUV) 环介导等温扩增 可视化 快速检测

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1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定 被引量：10

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作者 刘莉 顾玲玲 +3 位作者 张硕 谢军 朱善元 王安平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第1期368-374,共7页

【目的】利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒(Goose astrovirus 1,GAstV-1)结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a(... 【目的】利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒(Goose astrovirus 1,GAstV-1)结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1∶128000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。【结论】原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。 展开更多

关键词 1型鹅星状病毒(GAstV-1) ORF2基因 原核表达 多克隆抗体

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细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4增强传染性法氏囊病病毒VP2质粒DNA的免疫效应分析 被引量：3

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作者 王永娟 朱善元 +2 位作者 李碧春 胡成 左伟勇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期824-829,共6页

为评价分子佐剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)对IBDV VP2质粒DNA的免疫增强作用,试验采用重组质粒载体表达重组蛋白mLTA-VP2-CTLA-4和mLTA-CTLA-4,家兔毒性试验确定其安全性,后选择10日龄非免疫健康鸡进行随机分组试验,设不同剂量... 为评价分子佐剂细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)对IBDV VP2质粒DNA的免疫增强作用,试验采用重组质粒载体表达重组蛋白mLTA-VP2-CTLA-4和mLTA-CTLA-4,家兔毒性试验确定其安全性,后选择10日龄非免疫健康鸡进行随机分组试验,设不同剂量mLTA-CTLA-4加IBD活疫苗免疫组、不同剂量mLTAVP2-CTLA-4免疫组、IBD活疫苗免疫组及空白对照组,免疫后用ELISA法定期检测鸡血清抗体IgG及小肠黏膜抗体IgA效价;鸡在加强免疫后用IBDV野生毒株攻击,连续观察2周并计算保护率。结果显示,mLTA-VP2-CTLA-4免疫组、mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平与活疫苗免疫组无明显差别,mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫组产生的IgG和IgA抗体水平略高于mLTA-VP2-CTLA-4免疫组,疫苗对鸡的保护率为100%。结果表明,构建的IBDV分子佐剂DNA疫苗载体能表达无毒性的重组蛋白质,并能产生很好的免疫保护率,为进一步研究IBD亚单位疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病 分子佐剂 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 VP2 DNA疫苗

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大肠埃希菌ETT2毒力岛ECs3703基因和HPI毒力岛irp2基因双重LAMP检测方法的建立 被引量：4

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作者 蔡树东 成大荣 +2 位作者 朱善元 吴双 左伟勇 《动物医学进展》 北大核心 2017年第1期1-5,共5页

根据GenBank中大肠埃希菌ETT2毒力岛保守基因ECs3703和HPI毒力岛的保守基因irp2分别设计一套LAMP引物,在同一体系中进行LAMP扩增,通过对体系Mg2+、dNTP、内引物及反应温度和反应时间等进行优化,建立了在60℃恒温下对大肠埃希菌ETT2和HP... 根据GenBank中大肠埃希菌ETT2毒力岛保守基因ECs3703和HPI毒力岛的保守基因irp2分别设计一套LAMP引物,在同一体系中进行LAMP扩增,通过对体系Mg2+、dNTP、内引物及反应温度和反应时间等进行优化,建立了在60℃恒温下对大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛进行同步检测的LAMP方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的双重LAMP检测方法同时检测ETT2和HPI毒力岛大肠埃希菌检测限均可达到100fg,比常规PCR灵敏度高100倍。利用该方法对8株非大肠埃希菌进行LAMP扩增,结果均为阴性。用该方法对采集的20份临床样品进行检测,与双重PCR检测结果一致。结果显示,该双重LAMP方法可用于大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛的同步快速检测,可作为临床疫病诊断的有效手段。 展开更多

关键词 大肠埃希菌 ETT2毒力岛 HPI毒力岛 双重LAMP

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利用宏病毒组学对鹅痛风病原的鉴定 被引量：4

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作者 王安平 郝福星 +3 位作者 张硕 谢军 刘莉 朱善元 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第12期4661-4670,共10页

为确定2020年江苏盐城一鹅场雏鹅痛风的病原,试验对病料样品进行宏病毒组测序,通过比对分析原始数据发现疑似病原;通过从头组装获得其全基因组序列,并进行相似性比对和遗传进化分析;通过对疑似病毒的分离、鉴定和动物回归试验进行验证... 为确定2020年江苏盐城一鹅场雏鹅痛风的病原,试验对病料样品进行宏病毒组测序,通过比对分析原始数据发现疑似病原;通过从头组装获得其全基因组序列,并进行相似性比对和遗传进化分析;通过对疑似病毒的分离、鉴定和动物回归试验进行验证。宏病毒组学测序结果显示,在获得的全部599733条原始读长(reads)中,病毒reads有278593条,其中鹅星状病毒序列占95%,未发现其他疑似病毒序列;经从头组装获得了一条完整的鹅星状病毒全基因组序列,命名为YC20,该病毒基因组全长7137 nt,GenBank登录号为:MW536497,基因组结构及特征与其他星状病毒相同。全基因组序列相似性比对结果显示,YC20与新型鹅星状病毒SD01相似性最高,达98.2%;遗传进化分析结果显示,YC20与其他新型鹅星状病毒在同一分支,属于新型鹅星状病毒。禽胚分离结果显示,用鹅胚进行病原分离时,前3代次未出现死亡,第5代次后,可对鹅胚100%致死,而用SPF鸡胚或SPF鸭胚分离病原时,均未出现病变或死亡,PCR检测亦为阴性;纯化的尿囊液经负染后,电镜下可见大小约25 nm的病毒粒子。雏鹅回归试验结果显示,YC20接种3日龄雏鹅后,第6~8天出现死亡高峰期,死亡率为58.3%,剖检死亡鹅可见心脏、肝脏表面覆盖一层白色包膜,膝关节有大量白色颗粒样沉淀,肾脏充血肿大。以上结果说明,该鹅场痛风的病原为新型鹅星状病毒。本研究将宏病毒组学与传统的病毒分离鉴定技术相结合,证实了鹅痛风的病原,对病原的鉴定和研究具有指导意义。 展开更多

关键词 痛风 鹅星状病毒 宏病毒组学 分离 鉴定

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鸭瘟病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用 被引量：5

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作者 马丽丽 吴双 +5 位作者 胡成 左伟勇 洪伟鸣 王永娟 贾宁 朱善元 《动物医学进展》 北大核心 2015年第4期27-31,共5页

为建立一种简便、快速、灵敏度高、特异性好的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,根据GenBank中公布的DPV UL6基因组序列,设计了3对特异性引物,建立了LAMP快速检测方法。该方法的灵敏度可达0.1fg,对其他鸭常见病原体检测结果均为阴性,扩增反应只需... 为建立一种简便、快速、灵敏度高、特异性好的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,根据GenBank中公布的DPV UL6基因组序列,设计了3对特异性引物,建立了LAMP快速检测方法。该方法的灵敏度可达0.1fg,对其他鸭常见病原体检测结果均为阴性,扩增反应只需在水浴锅中60min内即可完成,可通过肉眼观察颜色变化直接判定结果。结果表明,所建立的LAMP方法简便快捷,省时省力,是适用于现场和基层实验室快速、准确检测DPV的分子生物学方法。 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 环介导等温扩增技术 检测

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鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定 被引量：2

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作者 王安平 朱善元 +3 位作者 王永娟 吴双 左伟勇 洪伟鸣 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第11期2862-2866,共5页

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV)F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选... 为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV)F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。 展开更多

关键词 鸭源新城疫病毒 F基因 昆虫细胞 表达

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慢病毒介导siRNA抑制1型鸭肝炎病毒复制 被引量：1

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作者 王永娟 董亚青 +4 位作者 朱善元 王安平 洪伟鸣 吴双 左伟勇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期522-529,共8页

为筛选能抑制DHAV-1复制的siRNA,探索RNAi技术在鸭病毒性肝炎防治中的应用,采用PCR法扩增DHAV-1 RdRp基因,并构建pEGFP-RdRp融合表达EGFP-RdRp蛋白;根据RdRp的序列测定结果,设计3条RdRp特异siRNA,并合成相应shRNA分别插入pmiRZipΔ中构... 为筛选能抑制DHAV-1复制的siRNA,探索RNAi技术在鸭病毒性肝炎防治中的应用,采用PCR法扩增DHAV-1 RdRp基因,并构建pEGFP-RdRp融合表达EGFP-RdRp蛋白;根据RdRp的序列测定结果,设计3条RdRp特异siRNA,并合成相应shRNA分别插入pmiRZipΔ中构建pRdRp-shRNA;共转染pRdRp-shRNA和pEGFP-RdRp于HEK-293T细胞,通过荧光显微镜法、流式细胞术、相对荧光定量PCR法筛选抑制效率较高的siRNA;将高效siRNA用于病毒载体pmiRZip介导的慢病毒制备;通过计算重组慢病毒转导、DHAV-1感染的鸭胚胎成纤维细胞中病毒TCID50和RdRp基因表达量确定siRNA对病毒及病毒基因的抑制作用。结果显示,3个siRNA均能抑制RdRp基因的表达,包含GDD模体的shRNA2的抑制率最高,对应重组病毒能使DHAV-1的TCID50下降6.2lg,RdRp基因转录量下降89.6%,抑制时间至少达120h,为鸭病毒性肝炎临床防治提供了新思路。 展开更多

关键词 鸭病毒性肝炎 GDD模体 RDRP RNA干扰 siRNA

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定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体夹心ELISA方法的建立与应用 被引量：1

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作者 夏文龙 吴植 +5 位作者 郭长明 朱善元 余树培 张鑫宇 夏晓莉 孙怀昌 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第4期881-887,共7页

为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素(Sn)游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离... 为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素(Sn)游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离受体作为标准抗原,鼠抗猪Sn免疫血清为一抗,生物素标记兔抗猪Sn多克隆抗体为二抗,建立定量检测Sn4D-Fc游离受体的双抗体夹心ELISA方法;用rAd-Sn4D-Fc注射仔猪,定期采集血清进行游离受体检测。结果显示,纯化Sn4D-Fc标准抗原的纯度为94.3%,能被Sn免疫血清识别;一抗的最佳工作浓度为5μg/mL蛋白,二抗的最佳稀释度为1∶4 000,夹心ELISA检测标准抗原的灵敏度为0.4ng/mL,对照抗原无交叉反应;夹心ELISA能从重组腺病毒注射猪血清中检测到Sn4D-Fc游离受体,最高表达量为6.54ng/mL,持续时间为15d。研究结果表明,建立的双抗体夹心ELISA可用于PRRSV游离受体的体内外定量检测。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 游离受体 夹心ELISA 定量检测

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鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定 被引量：1

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作者 张力 许加龙 +8 位作者 黄锦钰 许子月 雷昕诺 卢会鹏 朱睿 孙伟翔 曹海月 王安平 朱善元 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4186-4195,共10页

旨在建立鹅骨骼肌卫星细胞体外分离、培养、纯化及鉴定的方法。本研究选取健康10周龄溆浦鹅仔鹅为试验材料,采用分散酶Dispase II和胶原酶II共同作用肌肉组织分离得到卫星细胞,利用差速贴壁法纯化卫星细胞,在体外培养过程中,含有20%FBS... 旨在建立鹅骨骼肌卫星细胞体外分离、培养、纯化及鉴定的方法。本研究选取健康10周龄溆浦鹅仔鹅为试验材料,采用分散酶Dispase II和胶原酶II共同作用肌肉组织分离得到卫星细胞,利用差速贴壁法纯化卫星细胞,在体外培养过程中,含有20%FBS并添加bFGF的DMEM/F12生长完全培养基能较好维持卫星细胞的分化潜能,培养过程中涉及的培养皿需经基质胶特别包被处理;诱导分化出成熟肌管后,采用免疫荧光法和Western blotting检测肌球蛋白重链MyHC的表达,采用qRT-PCR检测Pax7、MyoD1、MyoG基因在诱导分化前(growth medium,GM)和分化后(differentiation medium,DM)的相对表达量,分化前后每组均3个重复。结果表明,新分离得到的卫星细胞体积较小,折光性强,贴壁后呈中间彭起两端针状的梭形结构,经免疫荧光鉴定呈Pax7阳性;诱导分化后可形成成熟多核肌管,免疫荧光检测成肌特异性标志MyHC呈阳性,统计分化指数高达78%(P<0.01);qRT-PCR检测标志性基因Pax7、MyoD1、MyoG呈阳性,并且分化前Pax7基因相对表达量是分化后的2.22倍(P<0.01),而分化后标志性基因MyoD1、MyoG的相对表达量分别是分化前的1.90(P<0.01)和44.22倍(P<0.01);Western blotting结果显示分化后MyHC蛋白表达水平明显升高。综上所述,本研究建立了一种基于胶原酶Ⅱ和分散酶Dispase II的混合酶分离鹅骨骼肌卫星细胞的方法,提供的培养体系能够使细胞在体外培养过程中维持巨大的分化潜能,为鹅肌肉组织生长发育分子调控机制的研究提供了良好的细胞模型。 展开更多

关键词 鹅 骨骼肌卫星细胞 分离 培养 鉴定

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