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代谢工程改造枯草芽孢杆菌促进L-赖氨酸高效合成研究 被引量:1
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作者 张晓霞 陈胜玲 +2 位作者 朱枝群 康春涛 徐建中 《轻工学报》 北大核心 2022年第5期1-11,共11页
为了构建具有益生功能和L-赖氨酸合成功能的“双功能”枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重组菌株,对饲料工业常用的益生菌B.subtilis ACCC11025进行系统的代谢工程改造。结果表明:以来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的ly... 为了构建具有益生功能和L-赖氨酸合成功能的“双功能”枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重组菌株,对饲料工业常用的益生菌B.subtilis ACCC11025进行系统的代谢工程改造。结果表明:以来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的lysC^(311)、zwf^(234)和gnd^(361)替换B.subtilis中的thrD、zwf和gnd,即构建重组菌B.subtilis XH4,有利于L-赖氨酸的合成,其产量达到(20.3±1.9)g/L;将B.subtilis中hom替换成来源于C.glutamicum的hom^(59),即构建重组菌B.subtilis XH5,可显著降低副产物积累量,提高L-赖氨酸产量至(23.2±1.7)g/L,且不影响菌体生长;在重组菌B.subtilis XH5中引入C.glutamicum中的DapDH会改变二氨基庚二酸途径(DAP)碳分布进而促进L-赖氨酸的合成,目标重组菌B.subtilis XH6的L-赖氨酸产量达到(25.6±2.3)g/L。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 L-赖氨酸合成 CRISPR-Cas9 反馈调节 代谢工程
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整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达 被引量:4
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作者 陈珊珊 丁健 +5 位作者 李鑫 刘军 贾禄强 槐强强 孙佼文 史仲平 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期20-28,共9页
人源溶菌酶作为一种天然的抑菌活力物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。本研究将信号肽序列和人源溶菌酶基因碱基序列作为一个整体进行密码子优化。并在优化的信号肽序列2处位置,共新插入39个碱基,构成增长的优化信号肽... 人源溶菌酶作为一种天然的抑菌活力物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。本研究将信号肽序列和人源溶菌酶基因碱基序列作为一个整体进行密码子优化。并在优化的信号肽序列2处位置,共新插入39个碱基,构成增长的优化信号肽+溶菌酶优化基因。将2种优化的信号肽+溶菌酶基因碱基序列分别插入pPICZαA载体上,并整合到毕赤酵母KM71的基因组上,获得重组子K1(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因)和K4(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽)。摇瓶诱导表达72 h后,离心取上清液,通过Bradford法和比浊法测定发现,K4的蛋白质表达量和酶活力均高于K1。5 L发酵罐下,采用高密度诱导表达策略,诱导54 h后K4的总蛋白质表达量可达3.02 g/L,所表达的人源溶菌酶活力达到324 072.0 U/ml。表明整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽有利于提高溶菌酶的分泌效率,实现高效表达。 展开更多
关键词 人源溶菌酶 信号肽序列 毕赤酵母 高效表达
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响应面法优化黑曲霉产葡萄糖氧化酶发酵条件 被引量:2
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作者 范新蕾 肖成建 +2 位作者 顾秋亚 罗玮 余晓斌 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1096-1100,共5页
为了提高葡萄糖氧化酶的产量,通过响应面法对诱变后的黑曲霉菌株的发酵条件进行优化,首先利用Plackett-Burman设计筛选出对酶活影响最显著的因素:牛肉膏蛋白胨、吐温-60和磷酸氢二铵;继而用最陡爬坡实验逼近最大影响区域;最后利用Box-Be... 为了提高葡萄糖氧化酶的产量,通过响应面法对诱变后的黑曲霉菌株的发酵条件进行优化,首先利用Plackett-Burman设计筛选出对酶活影响最显著的因素:牛肉膏蛋白胨、吐温-60和磷酸氢二铵;继而用最陡爬坡实验逼近最大影响区域;最后利用Box-Behnken设计及其响应面分析确定最优的发酵培养基(g/L):蔗糖87.5,牛肉膏蛋白胨3.15,NH4NO31.88,(NH4)2HPO40.34,KH2PO40.25,Tw-60 30.47,玉米粉12.5,培养基优化后的发酵酶活为87.5 U/m L,与优化前(45.27 U/m L)相比提高了93.28%。在7 L发酵罐中对显著影响因素吐温-60的不同添加时间进行对比,确定对数期流加吐温-60可以显著提高发酵的酶活,发酵后酶活为92.88 U/m L。 展开更多
关键词 葡萄糖氧化酶 响应面法 黑曲霉
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固态发酵低次烟叶制备的提取液成分分析 被引量:3
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作者 王宜君 汤朝起 +1 位作者 严新龙 许赣荣 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期757-764,共8页
对低次烟叶分别进行高温高水分好氧和厌氧发酵,烘干,陈化一周后制备提取液,应用顶空固相微萃取气质联用HS-SPME-GC-MS对不同提取液中的挥发性致香成分进行分析比较,并将浓缩后提取液涂布于片基上进行评吸。结果表明,经高温高水分好氧和... 对低次烟叶分别进行高温高水分好氧和厌氧发酵,烘干,陈化一周后制备提取液,应用顶空固相微萃取气质联用HS-SPME-GC-MS对不同提取液中的挥发性致香成分进行分析比较,并将浓缩后提取液涂布于片基上进行评吸。结果表明,经高温高水分好氧和厌氧发酵低次烟叶制备的提取液中挥发性致香成分种类分别为52种、51种,合计质量浓度分别为43.38μg/m L、40.16μg/m L。而未经发酵低次烟叶制备的提取液中挥发性致香成分种类为34种,合计质量浓度为23.61μg/m L;低次烟叶经固态发酵后所得提取液中酸类、酯类、酮类、醇类、醛类、杂环类等致香成分均有不同程度的增加,増香除杂效果明显,能够改善烟草薄片的吸食品质。 展开更多
关键词 低次烟叶 发酵 萃取液 香气成分
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白酒细菌酒曲固态培养条件下B.subtilis S12产四甲基吡嗪的合成机制 被引量:20
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作者 吴建峰 徐岩 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期8-15,共8页
四甲基吡嗪又名川芎嗪,是白酒中重要的风味成分,但其在白酒酿造过程的形成机制尚不明晰。为了探索白酒固态酿造体系中四甲基吡嗪的合成机制,作者从白酒细菌曲中分离得到一株产四甲基吡嗪菌株B.subtilis S12,并对细菌曲固态培养条件下四... 四甲基吡嗪又名川芎嗪,是白酒中重要的风味成分,但其在白酒酿造过程的形成机制尚不明晰。为了探索白酒固态酿造体系中四甲基吡嗪的合成机制,作者从白酒细菌曲中分离得到一株产四甲基吡嗪菌株B.subtilis S12,并对细菌曲固态培养条件下四甲基吡嗪的合成机制进行了探究。结果表明:固态条件下B.subtilis S12合成四甲基吡嗪分两步来进行:第一步,在全细胞催化下细菌利用底物合成四甲基吡嗪的前提物质3-羟基丁酮,同时氨基酸残基在氨基酸脱氢酶作用下生成氨;第二步,3-羟基丁酮和氨在热动力作用下生成四甲基吡嗪。 展开更多
关键词 B SUBTILIS S12 固态发酵 四甲基吡嗪 合成机制
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凝血因子Ⅶ高表达细胞的高通量筛选方法 被引量:1
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作者 彭林 李成媛 +3 位作者 熊文典 蔡燕飞 金坚 李华钟 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期722-726,共5页
针对哺乳动物细胞表达克隆的耗时较长的筛选过程,作者通过流式细胞仪对细胞进行快速筛选和纯度检测。利用流式细胞仪对电转细胞进行分选,利用点杂交和western blot方法筛选高表达克隆。流式细胞仪分选后的细胞,经点杂交和WB检测后获得的... 针对哺乳动物细胞表达克隆的耗时较长的筛选过程,作者通过流式细胞仪对细胞进行快速筛选和纯度检测。利用流式细胞仪对电转细胞进行分选,利用点杂交和western blot方法筛选高表达克隆。流式细胞仪分选后的细胞,经点杂交和WB检测后获得的CHO-r FVII-1细胞,表达r FVII细胞的比例为99.9%,同时与传统筛选方法获得的CHO-r FVII克隆比较后发现,两株细胞具有相同的r FVII产量。作者基于流式细胞仪建立了快速筛选高表达重组药物蛋白克隆的筛选的高通量方法和纯度检测的方法,为其他在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的筛选提供参考。 展开更多
关键词 高通量 中国仓鼠卵巢细胞 流式细胞仪 重组蛋白
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重组大肠杆菌全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸 被引量:2
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作者 Umutumwa Eric Principe 乔郅钠 +5 位作者 龙梦飞 邵明龙 徐美娟 杨套伟 张显 饶志明 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期26-35,共10页
4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E.co... 4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E.coli BL21(DE3)中的异源表达。其次,通过同源建模和蛋白质结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成丙氨酸Ala的原则,对I156位点进行了定点突变,以增大底物结合口袋,扩宽底物通遒进而提高4-HIL的产量。最后,对野生酶及突变酶的酶学性质、突变酶的羟基化反应体系进行研究,在最优催化条件下,分批补料转化底物进行4-HIL的生产。酶学性质结果显示,野生酶及突变酶I156A的最适温度均为25℃,最适pH均为7.0;突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍,L-ILe转化率提高了28%。羟基化反应体系的最优转化条件为:20 mmol/L L-ILe,20 mmol/Lα-酮戊二酸,8 mmol/L Fe^(2+),30 mmol/L抗坏血酸和HEPES(50 mmol/L,pH 7.0)缓冲液。在最优转化条件下,重组菌E.coli BL21/pET28a-ido^(I156A)进行分批补料转化底物,时间间隔为4 h,32 h后得到77.3 mmol/L 4-HIL,底物最高转化率98.35%e。 展开更多
关键词 L-异亮氨酸 L-异亮氨酸羟化酶 4-羟基异亮氨酸 定点突变 酶学性质 催化体系
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高效降解牛奶过敏原蛋白酶菌种筛选及其重组植物过氧化氢酶的功能验证 被引量:2
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作者 汤恒 张娟 堵国成 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期28-34,共7页
αs1酪蛋白是奶制品中主要的过敏原,为了高效地去除过敏原,从3000株左右野生菌中筛选获得一株脱敏效果好的枯草芽孢杆菌S7,并分别采用高效液相色谱技术(HPLC)和液相色谱串联二级质谱(LC-MS/MS)分析了目标菌中关键酶制备的脱敏奶制品的... αs1酪蛋白是奶制品中主要的过敏原,为了高效地去除过敏原,从3000株左右野生菌中筛选获得一株脱敏效果好的枯草芽孢杆菌S7,并分别采用高效液相色谱技术(HPLC)和液相色谱串联二级质谱(LC-MS/MS)分析了目标菌中关键酶制备的脱敏奶制品的风味与生成的生物活性多肽。通过与另一株枯草芽孢杆菌S21对比后发现,S7具有更高的水解α_(s1)酪蛋白的酶活,为分析这种差异,通过肽指纹图谱鉴定,发现S7可分泌表达更多的植物过氧化氢酶,对该酶进行重组表达后,回补至S21发酵液上清液中,发现S21水解αs1酪蛋白的酶活提升了约1.5倍,达到与S7相似的水平。结果表明,重组植物过氧化氢酶可辅助蛋白酶进行水解,从而提高了蛋白酶水解过敏原的酶活。枯草芽孢杆菌S7中的关键酶制备的脱敏奶制品具有较好的食品工业应用价值。 展开更多
关键词 α_(s1)酪蛋白 枯草芽孢杆菌S7 植物过氧化氢酶 酪蛋白胶粒 二硫键
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