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题名AMPK对过氧化氢诱导细胞衰老的阻遏研究
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作者
陈翠
龚蕾
徐晢
汪小波
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机构
曲靖医学高等专科学校机能与形态研究所
大理大学基础医学院
云南省高校细胞生物学重点实验室
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出处
《中国畜牧兽医》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第6期2255-2264,共10页
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基金
国家自然科学基金地区科学基金项目(81860158)
曲靖医学高等学校校级项目(2022XF003)。
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文摘
【目的】构建稳定表达腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/AMPK-T172D的NIH3T3细胞株,探讨AMPK对过氧化氢(hydrogen peroxide,H 2O 2)诱导的细胞衰老的影响。【方法】采用PCR扩增AMPK基因及其突变形式AMPK-T172D,将其克隆至慢病毒载体pLVX-IRES-Puro中,构建pLVX-IRES-AMPK/AMPK-T172D重组质粒并进行双酶切验证。将构建好的重组质粒包装成慢病毒,感染NIH3T3细胞,并利用嘌呤霉素筛选获得NIH3T3稳转细胞株。采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测稳转细胞株中AMPK的mRNA和蛋白表达情况。利用8.8 mmol/L H 2O 2处理AMPK/AMPK-T172D过表达NIH3T3细胞株,培养2 d后,采用衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase,SA-β-Gal)染色检测细胞衰老情况,利用实时荧光定量PCR检测p 53、p 21及IL-6基因的表达情况。【结果】双酶切验证结果显示,pLVX-IRES-AMPK/AMPK-T172D表达质粒构建成功。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,与对照组相比,AMPK/AMPK-T172过表达的NIH3T3细胞中AMPK和AMPK-T172D mRNA和蛋白表达水平均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05),肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT-1)和脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)mRNA表达水平显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),SA-β-Gal细胞阳性率极显著降低(P<0.01);p 53、p 21和IL-6基因mRNA表达水平显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01)。【结论】试验成功获得AMPK/AMPK-T172D过表达NIH3T3稳转细胞株,激活AMPK能降低H 2O 2诱导的衰老细胞中SA-β-Gal细胞阳性率和衰老相关因子p53、p21和IL-6的表达。试验结果为研究AMPK在衰老中的作用、可能的分子机制及抗衰老治疗策略提供依据。
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关键词
AMPK基因
持续激活型
稳转细胞株
NIH3T3细胞
衰老
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Keywords
AMPK gene
sustained activation type
stable cell line
NIH3T3 cell
aging
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分类号
Q255
[生物学—细胞生物学]
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