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琼枝麒麟菜多糖抗呼吸道病毒活性研究 被引量:11
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作者 邹沐平 董栋 +3 位作者 王怀玲 王巧利 蒲含林 王一飞 《海洋科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期15-20,共6页
为了评价琼枝麒麟菜多糖(EGP)包括粗提物(CEGP)及大于500 k Da多糖组分(LEGP)抗呼吸道相关病毒活性。采用Reed-muench法计算流感病毒H1N1、H3N2和H5N3,柯萨奇病毒CVB3及呼吸道合胞病毒RSV-long株滴度;采用观察细胞病变效应(CPE)法,确定C... 为了评价琼枝麒麟菜多糖(EGP)包括粗提物(CEGP)及大于500 k Da多糖组分(LEGP)抗呼吸道相关病毒活性。采用Reed-muench法计算流感病毒H1N1、H3N2和H5N3,柯萨奇病毒CVB3及呼吸道合胞病毒RSV-long株滴度;采用观察细胞病变效应(CPE)法,确定CEGP和LEGP对犬肾细胞(MDCK),人宫颈癌细胞(He La)和人喉癌上皮细胞(HEp-2)的最大无毒浓度;通过细胞病变观察法(CPE)及四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定CEGP和LEGP抑制各病毒产生细胞病变的作用。结果表明:CEGP和LEGP对5种常见的呼吸道病毒H1N1、H3N2和H5N3,CVB3和RSV都有抑制作用,CVB3和RSV对CEGP和LEGP更敏感;CEGP和LEGP有抗多种呼吸道病毒作用,为抗呼吸道病毒新药的研发提供理论依据。 展开更多
关键词 琼枝麒麟菜多糖 抗病毒 呼吸道病毒
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NDPK-A C4/109/145S突变体降低磷酸转移酶活性但增加DNase活性
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作者 高雪 张志红 +3 位作者 吕芬 钱垂文 王一飞 熊盛 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期260-266,共7页
核苷二磷酸激酶A(nucleoside diphosphate kinase A,NDPK-A)有广泛的生物学活性,在肿瘤转移和调控中起重要作用.单独抑制NDPK-A中任何1个Cys所形成的二硫键,不会降低NDPK-A的磷酸转移酶活性和DNase活性.本实验通过构建C4/109/145S突变... 核苷二磷酸激酶A(nucleoside diphosphate kinase A,NDPK-A)有广泛的生物学活性,在肿瘤转移和调控中起重要作用.单独抑制NDPK-A中任何1个Cys所形成的二硫键,不会降低NDPK-A的磷酸转移酶活性和DNase活性.本实验通过构建C4/109/145S突变体并研究其生物学效应,为NDPK-A结构与功能的研究提供参考.用定点突变法将NDPK-A的4位、109位和145位Cys突变为Ser,构建pBV220-NDPK-A C4/109/145S和pEGFP-NDPK-A C4/109/145S两种重组质粒.在大肠杆菌中高效表达NDPK-A C4/109/145S突变体,纯化后可获得均一的重组NDPK-A C4/109/145S突变体蛋白.HPLC法和DNA消化法测定发现,C4/109/145S突变体磷酸转移酶活性低于野生型NDPK-A,而DNase活性高于野生型NDPK-A.以A549细胞作为模式细胞的流式细胞仪周期检测表明,C4/109/145S突变体与野生型NDPK-A一致,均可将细胞周期延滞在S期和G2/M期.这些结果证实,NDPK-A结构异构与其磷酸转移酶活性密切相关,其酶活性至少需要1个Cys残基存在,NDPK-A结构中的二硫键也可能是其DNase活性的负调控机制之一,胞内NDPK-A的氧化还原异构可能对细胞周期无显著影响. 展开更多
关键词 核苷二磷酸激酶A 定点突变 磷酸转移酶活性 DNA酶活性 细胞周期
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GST-NDPK-A融合蛋白的原核表达及体外互作蛋白的检测
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作者 吕芬 刘忠 +6 位作者 银兴峰 赵振岭 陈妙娟 张嘉萱 陈伟 钱垂文 熊盛 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期137-143,共7页
旨在了解核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)的功能,通过GST-Pull down技术寻找与其存在体外相互作用的蛋白。以含有目的片段的质粒pBV-NDPK-A为模板,扩增出相应的目的基因片段,将其插入带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达质粒。双... 旨在了解核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)的功能,通过GST-Pull down技术寻找与其存在体外相互作用的蛋白。以含有目的片段的质粒pBV-NDPK-A为模板,扩增出相应的目的基因片段,将其插入带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达质粒。双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定融合蛋白的表达,并与高表达细胞系A549孵育,进行GST-Pull down试验,并通过LC-MS/MS质谱鉴定体外与NDPK-A相互作用的蛋白。结果显示,成功构建GST-NDPK-A的原核表达载体;在大肠杆菌BL21中诱导表达出可溶性融合蛋白;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了有生物活性的GST-NDPK-A融合蛋白,GST-Pull down试验和质谱鉴定结果发现NDPK-A与Fussel-18、Rrp12体外存在相互作用。 展开更多
关键词 NDPK-A Fussel-18 Rrp12 表达纯化 相互作用
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氧化还原对NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性的影响
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作者 张志红 吕芬 +3 位作者 高雪 杨依丽 罗勇 熊盛 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期129-135,共7页
对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)及其4种半胱氨酸突变体进行诱导表达及纯化,测定它们在氧化还原条件及正常条件下的磷酸转移酶活性,研究氧化还原及二硫键异构对NDPK-A及突变体活性的影响。将实验室之前构建成功的野生型NDPK-A(PBV-NDPK-A)及... 对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)及其4种半胱氨酸突变体进行诱导表达及纯化,测定它们在氧化还原条件及正常条件下的磷酸转移酶活性,研究氧化还原及二硫键异构对NDPK-A及突变体活性的影响。将实验室之前构建成功的野生型NDPK-A(PBV-NDPK-A)及4种突变型NDPK-A基因(PBV-NDPK-A C4S,PBV-NDPK-A C109S,PBV-NDPK-A C145S,PBV-NDPK-A C4/109/145S)在大肠杆菌中高效表达;以DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B亲和层析技术纯化目的蛋白;HPLC法测定比较野生型NDPK-A及突变体在氧化还原和正常环境下磷酸转移酶活性。结果显示,NDPK-A及突变体在大肠杆菌中高效表达;经纯化分别获得了均一的NDPK-A蛋白及突变体蛋白,纯度均达到98%;在还原环境下NDPK-A及突变体的磷酸转移酶活性均高于正常环境下的活性,但是在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境下。氧化还原环境对NDPK-A结构异构及磷酸转移酶活性有一定的影响,提示氧化还原环境可能调控NDPK-A二硫键的形成,影响蛋白的聚集状态,从而影响蛋白的磷酸转移酶活性,并且NDPK-A结构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制。 展开更多
关键词 核苷二磷酸激酶A 氧化还原 磷酸转移酶活性
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