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BVDV囊膜蛋白E2重组腺病毒的构建及免疫效果研究
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作者 吕雯雯 塞力克·杰恩斯 +4 位作者 叶鸿艳 张亚平 刘芯怡 史慧君 付强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1065-1071,共7页
为构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)囊膜蛋白E2重组腺病毒并分析其免疫效果。本研究通过PCR扩增获得目的基因BVDV E2,将其与穿梭载体pDC316-CMV-EFla-copGFP连接得到重组腺病毒载体,抽提质粒后酶切鉴定。将目的质粒与腺病毒骨架质粒p BHGlox-... 为构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)囊膜蛋白E2重组腺病毒并分析其免疫效果。本研究通过PCR扩增获得目的基因BVDV E2,将其与穿梭载体pDC316-CMV-EFla-copGFP连接得到重组腺病毒载体,抽提质粒后酶切鉴定。将目的质粒与腺病毒骨架质粒p BHGlox-ΔE1,3cre采用AdMax系统共转染至Low Passage 293细胞中得到重组腺病毒rAdv-E2,同时包装重组腺病毒rAdv-EGFP用于阴性对照并均经PCR和测序鉴定;将重组腺病毒rAdv-E2和rAdv-EGFP分别感染Low Passage 293细胞后扩繁,并采用RT-PCR和TCID_(50)检测目的基因的表达及腺病毒滴度;将BVDV E2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,使用IPTG诱导表达后经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化获得重组E2蛋白(rE2),用于后续特异性抗体的检测;以1×10^(8)TCID_(50)/只分别将重组腺病毒r Adv-E2和r Adv-EGFP经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,分别于第0、14 d两次免疫,首免后分别于7 d、14 d、21 d、28 d断尾采血,通过间接ELISA方法检测各组小鼠血清抗体水平;于首免后21 d时分别以BVDV TC株攻毒,于攻毒后0、5 d、10 d及15 d从各组小鼠中随机剖杀3只,取肝脏、肺脏、肾脏组织,使用福尔马林溶液固定小鼠各组织后,经脱水浸蜡、包埋、切片、HE染色后观察攻毒后各组小鼠的组织病理变化情况。结果显示,RT-PCR鉴定结果表明重组腺病毒r Adv-E2表达E2基因;ELISA检测结果显示,rAdv-E2组小鼠在免疫后7 d、14 d、21 d时抗体水平升高,28 d时显著升高,rAdv-EGFP组小鼠抗体水平无明显变化,rAdv-E2组小鼠的抗体水平整体极显著高于rAdv-EGFP组(P<0.001、P<0.0001),表明rAdv-E2诱导小鼠产生了良好的体液免疫反应;组织病理切片观察结果显示,BVDV攻毒后,接种rAdv-EGFP的对照组小鼠肝脏组织出现肝细胞变性坏死、水肿、炎性细胞增多,中央静脉有淤血产生;肺脏组织病变特征主要为肺泡破裂融合,炎性细胞浸润、出血、充血,黏膜脱落;肾脏组织有炎症产生,出现淋巴细胞浸润等病变特征,rAdv-E2免疫组小鼠各组织仅出现较轻的细胞病变,表明重组腺病毒r Adv-E2可以保护BALB/c小鼠免受BVDV的感染而致病。综上结果表明,重组腺病毒r Adv-E2将有望成为防控BVDV感染的新型疫苗。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 囊膜蛋白E2 腺病毒载体 免疫效果 病理变化
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牛肠病毒VP1基因重组腺病毒的构建及其对小鼠的免疫原性评价
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作者 马思琪 吕雯雯 +9 位作者 陈俊贞 李建林 刘昱成 关团 丁剑 刘浩然 叶鸿艳 杨莉 付强 史慧君 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第9期4615-4625,共11页
构建表达牛肠病毒(bovine enterovirus,BEV)结构蛋白VP1的重组腺病毒,并对其进行免疫原性和安全性的初步验证。首先,应用PCR扩增BEV VP1基因,并将其克隆至腺病毒载体pDC316-CMV-copGFP,获得的重组质粒pDC316-VP1-copGFP与pBHGlox-△E1,3... 构建表达牛肠病毒(bovine enterovirus,BEV)结构蛋白VP1的重组腺病毒,并对其进行免疫原性和安全性的初步验证。首先,应用PCR扩增BEV VP1基因,并将其克隆至腺病毒载体pDC316-CMV-copGFP,获得的重组质粒pDC316-VP1-copGFP与pBHGlox-△E1,3cre共转染至293细胞后,进行病毒滴度测定及RT-PCR鉴定;其次,构建pET-32a-BEV-VP1原核表达质粒,优化诱导时间和温度后纯化BEV VP1蛋白;同时,将阴性对照腺病毒rAdv-copGFP、重组腺病毒rAdv-VP1及空白对照PBS分别肌注免疫BALB/c小鼠,观察小鼠临床症状;随后于免疫21 d后感染BEV,并于攻毒第0、5、10、15天采集小鼠肝、肺、脾、肾、小肠,分别提取组织RNA并制作病理切片,检测各组织中病毒载量并观察组织病理变化;最后,使用ELISA检测免疫血清中总IgG抗体、特异性抗体、细胞因子IFN-γ和IL-4水平。结果显示:成功构建腺病毒载体pDC316-VP1-copGFP;筛选出最优VP1原核表达条件为37℃诱导8 h,成功纯化出pET-32a-BEV-VP1蛋白;腺病毒免疫小鼠血清能够识别纯化后的VP1蛋白;重组腺病毒免疫能使小鼠产生特异性抗体,从而提高体液免疫与细胞免疫水平。本研究成功构建表达BEV VP1蛋白的重组腺病毒,在免疫小鼠后能够较好地诱导小鼠体内产生体液免疫应答和细胞免疫应答,从而对BEV感染起到了一定的保护作用,为进一步研发BEV新型疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 牛肠病毒 重组腺病毒 结构蛋白VP1 细胞免疫
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牛肠道大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析 被引量：2
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作者 郑启铭 梁纤纤 +6 位作者 李晓卓 李月 刘文锴 韩翔舒 冯继红 翟少华 夏俊 《草食家畜》 2024年第1期31-36,共6页
【目的】新疆昌吉市周边某牛场大量犊牛严重腹泻,排黄色水样稀便,有的带血,并出现精神萎靡、食欲不振等症状,为确定此次发病的病原并提供治疗参考。【方法】通过对该牛场出现的犊牛腹泻粪样进行细菌鉴定及分型并进行耐药性分析。【结果... 【目的】新疆昌吉市周边某牛场大量犊牛严重腹泻,排黄色水样稀便,有的带血,并出现精神萎靡、食欲不振等症状,为确定此次发病的病原并提供治疗参考。【方法】通过对该牛场出现的犊牛腹泻粪样进行细菌鉴定及分型并进行耐药性分析。【结果】PCR鉴定结果显示为大肠杆菌阳性,染色镜检结果符合大肠杆菌形态特征,分离菌株具有K99黏附性基因。药敏试验结果显示该分离菌株仅对多黏菌素B中介(既不敏感也不耐药),对其他所有受试抗菌药物耐药。在致病性试验中,小鼠在15 h内陆续死亡,说明该菌株具有一定致病力。【结论】结果表明,该牛场犊牛腹泻粪便中分离的菌株为产肠毒素性大肠杆菌,携带K99毒力基因,对多黏菌素B中介,具有一定致病力。 展开更多
关键词 犊牛腹泻 大肠杆菌 药敏试验 K99
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