新疆南疆地区蜱蝇种类的鉴定与其携带的病原及遗传进化分析

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作者 戴君昂 赵晶 +8 位作者 邓兴梅 韩馨馨 刘雪峰 张会强 赵天艺 张旭 张豫 孙志华 张辉 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期199-206,共8页

为了解新疆南疆地区绵羊体外寄生虫蜱蝇(Melophagus)的种类及其携带的病原,本研究于新疆南疆共采集582只蜱蝇,其中昆玉市一牧场54只、皮山农场180只,克州阿克陶县348只。通过形态学和蜱蝇18S rRNA基因的PCR扩增鉴定蜱蝇种类及性别。通过... 为了解新疆南疆地区绵羊体外寄生虫蜱蝇(Melophagus)的种类及其携带的病原,本研究于新疆南疆共采集582只蜱蝇,其中昆玉市一牧场54只、皮山农场180只,克州阿克陶县348只。通过形态学和蜱蝇18S rRNA基因的PCR扩增鉴定蜱蝇种类及性别。通过PCR检测蜱蝇中的巴尔通体(Bartonella)rpoB及gltA基因;杀雄菌(Arsenophonus)、无形体(Anaplasma)、埃立克体(Ehrlichia)、沃尔巴克体(Wolbachia)的16S rRNA基因;立克次体(Rickettsia)的Omp A、17 ku及16S r RNA基因并测序,根据测序结果统计羊蜱蝇对上述病原的携带率。将测序结果经BLAST比对,分析与上述测序基因相似性最高的病原。采用邻接法构建巴尔通体rpoB、gltA基因及杀雄菌与沃尔巴克体16S rRNA基因的系统发育树,分析羊蜱蝇携带上述3种病原的种类。统计羊蜱蝇病原的携带率,并分析不同性别及地区对羊蜱蝇携带病原的影响。形态学及PCR鉴定结果显示,本实验采集的蜱蝇均为羊蜱蝇,其中雌性350只,雄性232只。PCR结果显示,羊蜱蝇中巴尔通体、杀雄菌和沃尔巴克体均为阳性,埃立克体、嗜吞噬细胞无形体、斑点热群立克次体均为阴性。经统计羊蜱蝇巴尔通体、杀雄菌及沃尔巴克体的携带率分别为100%(582/582)、39.9%(232/582)及70.9%(413/582),且有34.4%(200/582)的羊蜱蝇同时携带上述3种病原。BLAST比对及上述基因的遗传进化分析结果显示,羊蜱蝇携带的巴尔通体均为Bartonella melophagi;携带的杀雄菌均为内共生杀雄菌;携带的沃尔巴克体均为内共生沃尔巴克体。经统计雌性羊蜱蝇对杀雄菌的携带率高于雄性,雄性羊蜱蝇沃尔巴克体的携带率高于雌性;采样地点经纬度不同对羊蜱蝇携带的病原种类基本无影响,但随海拔升高,羊蜱蝇对这3种菌的共同携带率越高,且内共生杀雄菌及内共生沃尔巴克体均对羊蜱蝇的生殖起调控作用,推测高海拔不利于羊蜱蝇的生存。本实验全面分析了新疆南疆地区羊蜱蝇的种类及携带的病原,为新疆地区羊蜱蝇的防治提供参考依据。 展开更多

关键词 体外寄生虫 羊蜱蝇 病原

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新疆部分地区人蚤携带病原体检测及遗传进化分析

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作者 韩馨馨 赵晶 +6 位作者 刘雪峰 李益涛 吴婷婷 戴君昂 闫梦阳 孙志华 张辉 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第8期852-858,共7页

目的明确南疆部分地区绵羊体表跳蚤种属及携带病原体情况,并对相关病原体进行遗传进化差异分析,为当地跳蚤的防治和虫媒传染病的防控提供参考依据。方法收集图木舒克市、和田地区农牧区跳蚤1586只,通过形态学和人蚤(Pulex irritans)线粒... 目的明确南疆部分地区绵羊体表跳蚤种属及携带病原体情况,并对相关病原体进行遗传进化差异分析,为当地跳蚤的防治和虫媒传染病的防控提供参考依据。方法收集图木舒克市、和田地区农牧区跳蚤1586只,通过形态学和人蚤(Pulex irritans)线粒体COII基因鉴定跳蚤种类,提取蚤DNA,扩增巴尔通体(Bartonella)gltA基因、杀雄菌(Arsenophonus)、无形体(Anaplasma)、埃立克体(Ehrlichia)和沃尔巴克体(Wolbachia)16S rRNA基因;立克次体(Rickettsia)OmpA、17kDa、16S rRNA基因;鼠疫杆菌(Yersinia pestis)16S rDNA基因;对扩增产物测序。对检出的3种病原相应基因(巴尔通体gltA基因、沃尔巴克体及嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因)与GenBank中已知的相同病原相应基因进行比对和同源性分析。利用MEGA 11.0采用邻接法分别构建系统发育树。结果形态学及分子生物学鉴定结果显示,本次采集跳蚤均为人蚤。人蚤线粒体COII、巴尔通体gltA、沃尔巴克体和嗜吞噬细胞无形体16S rRNA的扩增产物均与预期片段大小相符;埃立克体、杀雄菌、斑点热群立克次体及鼠疫未扩增出目的条带。基于人蚤线粒体COII及上述病原相应基因的同源性及遗传进化分析结果显示,本研究所获得的图木舒克市人蚤与伊朗地区人蚤COX2基因(ON455234.1)同源性最高,达99.84%;和田地区人蚤与湖南地区人蚤COII基因(NC_063709.1)同源性最高,达100%;进一步确定跳蚤品种为人蚤。此次收集的人蚤携带多种病原,其中巴尔通体和沃尔巴克体感染率最高,嗜吞噬细胞无形体感染率较低。结论本研究首次对南疆部分地区绵羊体表跳蚤进行种属鉴定,初步明确巴尔通体、沃尔巴克体及嗜吞噬细胞无形体为人蚤携带的主要病原体。 展开更多

关键词 人蚤 病原 遗传进化

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阿莫西林降解菌的筛选及降解机制研究

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作者 闫梦阳 梁晓阳 +5 位作者 戴君昂 张妍 关团 张辉 刘良波 孙志华 《生物技术通报》 北大核心 2025年第9期314-325,共12页

【目的】筛选生猪粪污中阿莫西林(AMX)高效降解菌并优化其降解条件,明确AMX的降解产物及途径,为清除环境中抗生素残留提供依据和参考。【方法】采用抗生素驯化法和高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法对猪粪中AMX高效降解菌进行筛选,... 【目的】筛选生猪粪污中阿莫西林(AMX)高效降解菌并优化其降解条件,明确AMX的降解产物及途径,为清除环境中抗生素残留提供依据和参考。【方法】采用抗生素驯化法和高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法对猪粪中AMX高效降解菌进行筛选,通过形态学观察及16S rDNA测序对高效降解菌进行菌种鉴定。采用单因素试验法对AMX高效降解菌的培养条件进行优化。探究了培养温度、p H值、接种量、抗生素初始浓度等因素对菌株降解AMX的影响。利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)对阿莫西林降解过程中的产物进行了鉴定,以推测阿莫西林的降解途径。通过转录组测序,结合基因组学和生物信息学方法,对菌株AMX-1的DEGs进行了功能注释。【结果】分离筛选得到一株AMX高效降解菌,命名为菌株AMX-1,经形态学观察及分子生物学鉴定,菌株AMX-1被鉴定为大肠杆菌(Escherichia coli)。菌株AMX-1降解AMX的最佳条件为温度为35℃,pH为7.0,AMX初始浓度为50 mg/L,接种量为6%。在此条件下,48 h内AMX降解率达到100%。对AMX的降解产物进行鉴定,共鉴定出8种中间产物,提出了AMX的降解途径。转录组测序结果显示,786个降解必需基因通过头孢噻呋钠的水解而上调,基因注释结果表明AMX的降解与多种生物过程相关。【结论】成功从猪粪中筛选并鉴定出一株阿莫西林高效降解菌——大肠杆菌AMX-1。该菌株在优化条件下,48 h内对AMX的降解率可达100%。菌株AMX-1展现出的高效降解能力及明确的降解机制,为环境中阿莫西林残留的清除提供了重要的菌种资源和理论依据。 展开更多

关键词 阿莫西林 大肠杆菌 分离鉴定 转录组测序 降解机制

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核桃叶精油提取工艺优化及其抑菌、抗氧化、抗肿瘤、驱杀蜱虫活性研究

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作者 戴君昂 张乐苒 +8 位作者 赵晶 邓兴梅 闫梦阳 韩馨馨 刘雪峰 赵天艺 张旭 孙志华 张辉 《中成药》 北大核心 2025年第8期2703-2709,共7页

目的优化核桃叶精油提取工艺,并评价其抑菌、抗氧化、抗肿瘤、驱杀蜱虫活性。方法在单因素试验基础上,以料液比、超声时间、超声功率为影响因素,提取率为评价指标,Box-Behnken响应面法优化提取工艺,通过测定抑菌圈及最低抑菌浓度评价抑... 目的优化核桃叶精油提取工艺,并评价其抑菌、抗氧化、抗肿瘤、驱杀蜱虫活性。方法在单因素试验基础上,以料液比、超声时间、超声功率为影响因素,提取率为评价指标,Box-Behnken响应面法优化提取工艺,通过测定抑菌圈及最低抑菌浓度评价抑菌活性,测定DPPH、ABTS自由基清除能力评价抗氧化活性,MTT法测定对小鼠乳腺癌4T1细胞体外增殖的抑制活性,滤纸圈法、滤纸包法评价对图兰扇头蜱的驱杀能力。结果最佳条件为提取溶剂石油醚,料液比1∶20,超声时间30 min,超声功率200 W,提取率为0.077%。精油对粪肠球菌、链球菌、库特氏菌、金黄色葡萄球菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌有抑制作用,其中链球菌抑菌圈直径最大;对DPPH、ABTS自由基的IC_(50)值分别为0.532、0.344 mg/mL;对4T1细胞的IC_(50)值分别为115.3(24 h)、49.80(48 h)、24.00(96 h)μg/mL;对图兰扇头蜱的有效驱避时间为50 min,触杀LC_(50)值分别为4.5830(幼蜱)、22.442(若蜱)、45.441(成蜱)mg/mL。结论该方法稳定可靠,可用于提取抗氧化、抗肿瘤、驱杀蜱虫活性较强,抑菌活性较弱的核桃叶精油。 展开更多

关键词 核桃叶 精油 提取工艺 Box-Behnken响应面法 抑菌活性 抗氧化活性 抗肿瘤活性 驱杀蜱虫活性

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鼠伤寒沙门菌FtnB蛋白的生物信息分析及原核表达

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作者 魏铭清 丁颖 +5 位作者 刘非凡 王天辰 周霞 张倩 王震 张辉 《现代畜牧兽医》 2025年第8期7-13,共7页

试验旨在深入研究鼠伤寒沙门菌FtnB蛋白的潜在生物学功能并获取高纯度的蛋白样本。研究利用生物信息学技术对FtnB蛋白结构及翻译后修饰位点进行预测分析,将PCR扩增得到的鼠伤寒沙门菌FtnB基因插入pET-32a(+)载体中并转化至大肠杆菌BL21(... 试验旨在深入研究鼠伤寒沙门菌FtnB蛋白的潜在生物学功能并获取高纯度的蛋白样本。研究利用生物信息学技术对FtnB蛋白结构及翻译后修饰位点进行预测分析,将PCR扩增得到的鼠伤寒沙门菌FtnB基因插入pET-32a(+)载体中并转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,使用SDS-PAGE和Western blotting方法检测FtnB蛋白的表达水平。结果显示,FtnB蛋白属于亲水性蛋白,不含跨膜结构及信号肽;二级结构主要有α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠和延伸链;存在多个T、B细胞抗原表位及磷酸化、糖基化、甲基化修饰位点。根据蛋白互作预测分析结果显示,FtnB蛋白与norV和aphF蛋白之间存在相互作用。研究成功扩增了大小为524 bp的FtnB基因。通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定获得大小约为35.9 ku的FtnB蛋白。研究表明,试验成功克隆FtnB基因,并通过原核表达制备了FtnB蛋白,为进一步探索鼠伤寒沙门氏菌FtnB蛋白的功能研究提供了参考。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 生物信息学分析 原核表达

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石河子地区主要猪场猪流行性腹泻流行情况及防控调查 被引量：3

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作者 黄新 韩猛立 +3 位作者 张星星 吴桐忠 何延华 钟发刚 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2017年第12期47-49,共3页

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种急性、高度传播性的肠道疾病。该病以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征。各年龄猪均易感,尤其是哺育仔猪,发病率为100%,死亡率为80%~100%。2010年来,该病在我... 猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种急性、高度传播性的肠道疾病。该病以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征。各年龄猪均易感,尤其是哺育仔猪,发病率为100%,死亡率为80%~100%。2010年来,该病在我国大部分地区均有流行[1]。2013-2015年期间,石河子市及周边地区多个猪场出现2周龄内仔猪腹泻死亡的群发病例。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 石河子地区 流行情况 猪场 防控 急性肠炎 仔猪腹泻 肠道疾病

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生鲜乳中海氏肠球菌的分离鉴定 被引量：2

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作者 史超 张伟 +6 位作者 刘素平 寇茜茜 刘荣慧 于海涛 霍明凯 王震 张辉 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第7期58-64,共7页

为了解生鲜乳中是否存在肠球菌污染,本试验从石河子某奶牛场无菌采集7份生鲜乳样品,通过细菌分离纯化、生化鉴定、16S rRNA和肠球菌RNA聚合酶α亚基(rpoA)编码基因的扩增和序列分析对分离菌株进行菌种鉴定,并利用纸片扩散法药敏试验和... 为了解生鲜乳中是否存在肠球菌污染,本试验从石河子某奶牛场无菌采集7份生鲜乳样品,通过细菌分离纯化、生化鉴定、16S rRNA和肠球菌RNA聚合酶α亚基(rpoA)编码基因的扩增和序列分析对分离菌株进行菌种鉴定,并利用纸片扩散法药敏试验和小鼠致病性试验确定分离菌株的药物敏感性和致病性。结果显示,从生鲜乳中分离到1株细菌,其培养特性和生化特性与肠球菌相似,16S rRNA基因测序结果显示其为肠球菌,rpoA基因测序结果显示其分子特征符合海氏肠球菌;药敏试验结果显示,分离海氏肠球菌对氨基糖苷类、林可胺类、磺胺类和多肽类药物表现一定的耐药性,而对四环素类、β-内酰胺类和部分喹诺酮类药物具有不同程度的敏感性;小鼠致病性试验结果显示,该菌株具有一定的致病性。本试验基于生鲜乳中海氏肠球菌的分离鉴定、耐药性和致病性分析,初步说明该牛场乳品中存在肠球菌污染的风险,且分离菌株具有一定耐药性和致病性,因此需在日常生产加工环节加强监测。 展开更多

关键词 生鲜乳 海氏肠球菌 rpoA基因 耐药性 致病性

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布鲁氏菌BspF蛋白生物信息学分析及其对巨噬细胞炎症因子表达的影响 被引量：2

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作者 孙灿 魏硕 +6 位作者 鄢余静 赵天艺 朱德馨 邓兴梅 郭嘉 张辉 孙志华 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1846-1856,共11页

【目的】对布鲁氏菌BspF蛋白进行生物信息学分析,并进一步探究BspF蛋白对巨噬细胞炎症因子表达的影响。【方法】利用生物信息学在线软件分析布鲁氏菌BspF蛋白的理化性质、亲/疏水性、信号肽、跨膜区、抗原决定簇及结构域、二级结构、三... 【目的】对布鲁氏菌BspF蛋白进行生物信息学分析,并进一步探究BspF蛋白对巨噬细胞炎症因子表达的影响。【方法】利用生物信息学在线软件分析布鲁氏菌BspF蛋白的理化性质、亲/疏水性、信号肽、跨膜区、抗原决定簇及结构域、二级结构、三级结构。构建重组质粒pET-32a-BspF并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达BspF蛋白并进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting检测蛋白表达及纯化情况。通过CCK-8法检测纯化后BspF蛋白对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的毒性,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测BspF蛋白对细胞中炎症相关因子mRNA和蛋白表达的影响。【结果】BspF蛋白分子质量为48.75 ku,属于不稳定蛋白,具有15个抗原决定簇,不存在跨膜区域和信号肽,二级结构以α-螺旋为主。成功构建了布鲁氏菌BspF基因原核表达载体,诱导表达后获得大小为60 ku的目标蛋白。纯化后蛋白以50μg/mL终浓度刺激RAW264.7细胞24 h后,与对照组相比,BspF组细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA表达量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),NLRP3、Pro-Caspase-1蛋白表达量均极显著升高(P<0.01)。【结论】布鲁氏菌BspF蛋白能通过NLRP3炎症小体触发宿主细胞炎症反应,促进巨噬细胞炎症因子的表达。结果为布鲁氏菌致炎机制的研究和抗炎靶点的筛选提供理论基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BspF蛋白 生物信息学 原核表达 炎性因子

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单增李斯特菌IspD蛋白生物信息学分析及表达纯化 被引量：3

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作者 史超 张伟 +6 位作者 刘素平 张梦琦 何欣 赵明彦 周霞 王震 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3799-3810,共12页

【目的】对单增李斯特菌IspD蛋白的潜在生物学功能进行预测分析,并表达纯化IspD蛋白,为后续IspD蛋白的研究提供理论支撑。【方法】从NCBI中获得单增李斯特菌IspD的编码序列(基因ID:986270)和氨基酸序列(登录号:NP_464611.1),运用生物信... 【目的】对单增李斯特菌IspD蛋白的潜在生物学功能进行预测分析,并表达纯化IspD蛋白,为后续IspD蛋白的研究提供理论支撑。【方法】从NCBI中获得单增李斯特菌IspD的编码序列(基因ID:986270)和氨基酸序列(登录号:NP_464611.1),运用生物信息学软件对IspD蛋白编码序列进行开放阅读框分析,对氨基酸序列进行基本特性、空间结构、抗原表位、修饰化位点、蛋白互作及相似性等预测分析。对IspD蛋白编码序列进行密码子优化并合成,采用无缝克隆法构建重组质粒pET-32a-IspD并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将测序和双酶切验证正确的阳性克隆经IPTG低温过夜诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化得到IspD融合蛋白,利用SDS-PAGE和Western blotting验证IspD融合蛋白表达、纯化及反应原性。【结果】IspD蛋白编码基因为lmo1086,全长711 bp,共有4个开放阅读框,其中ORF1为最长的开放阅读框,可编码236个氨基酸。氨基酸序列分析显示,IspD蛋白无跨膜结构域、信号肽,是一种亲水性蛋白,亚细胞定位于细胞质中,为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷酰基转移酶。α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲参与了IspD蛋白二级结构的组成,三级结构模型预测与二级结构特点相符。IspD蛋白具有多个T、B细胞抗原表位、固定无序结构域、磷酸化、糖基化、甲基化及乙酰化修饰位点。蛋白互作分析显示,IspD蛋白与DXR、IspF、ipk等多个蛋白存在相互作用,IspD与其相互作用最强的DXR蛋白之间通过氢键、盐桥等实现连接和相互作用。试验成功构建了表达菌株pET-32a-IspD,SDS-PAGE结果显示,在上清中高表达IspD融合蛋白;Western blotting验证显示,纯化的IspD融合蛋白具有反应原性。【结论】IspD蛋白具有成为候选诊断、疫苗研发和药物靶点等的潜在价值。试验表达纯化得到IspD融合蛋白,可为后续IspD蛋白具体功能的研究提供理论依据。 展开更多

关键词 单增李斯特菌 IspD蛋白 生物信息学 表达 纯化

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布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究 被引量：4

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作者 邱润辉 关飞虎 +7 位作者 王梓行 郭嘉 朱德馨 张伟 魏春燕 霍明凯 孙志华 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1630-1640,共11页

【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合... 【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1800 V电压、400Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】试验成功获得片段大小为522、539、1054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BMCO基因缺失株 生长曲线 胞内生存

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布鲁氏菌分泌蛋白BspD多克隆抗体制备及其生物信息学分析 被引量：2

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作者 李芮芮 马忠臣 +4 位作者 张弘扬 王震 努尔赛力克·努素甫 王勇 陈创夫 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第2期676-684,共9页

本研究旨在获得布鲁氏菌BspD蛋白,制备其多克隆抗体,并分析其潜在生物学功能。根据流产布鲁氏菌(Brucella abortus)2308的BspD基因序列(GenBank登录号:NC_007618.1)获得BspD基因序列,对布鲁氏菌BspD氨基酸序列进行生物信息学分析,然后... 本研究旨在获得布鲁氏菌BspD蛋白,制备其多克隆抗体,并分析其潜在生物学功能。根据流产布鲁氏菌(Brucella abortus)2308的BspD基因序列(GenBank登录号:NC_007618.1)获得BspD基因序列,对布鲁氏菌BspD氨基酸序列进行生物信息学分析,然后将目的基因嵌入pMD19-T载体,使用限制性内切酶切下目的基因重组入pET-28a(+)载体,构建pET28a-BspD重组载体,经过双酶切、测序验证后,IPTG诱导表达菌株,SDS-PAGE法鉴定BspD的表达,His标签蛋白纯化柱纯化BspD蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度。用纯化BspD蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体的效价及反应原性。结果表明,成功表达出37 ku BspD蛋白,BCA方法测得纯化BspD浓度为2000μg/mL;Western blotting结果显示制备的抗体具有良好的特异性,间接ELISA检测出BspD多克隆抗体的效价为1∶12800,成功制备出BspD多克隆抗体,但其反应原性较低。生物学信息分析得出BspD蛋白具有亲水性,存在跨膜区,无信号肽,有17个磷酸化位点和11个抗原决定簇,BspD蛋白二级结构以α-螺旋为主,达到86.80%,还存在少量延伸链、无规则卷曲、β-折叠等;在线软件Phyre 2构建BspD三级结构证实其多为α-螺旋。以上结果可为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白BspD的功能及分子机制提供参考。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BspD分泌蛋白 生物信息学分析 多克隆抗体

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TGF-β1在布鲁氏菌致炎过程中的作用及其与NLRP3炎症小体的相关性研究 被引量：3

12

作者 陶婷婷 赵天艺 +5 位作者 李佳 朱德馨 邱润辉 王梓行 孙志华 张辉 《动物医学进展》 北大核心 2022年第2期48-53,共6页

建立牛布鲁氏菌2308感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,用RT-qPCR检测感染细胞中TGF-β1在mRNA水平的变化;ELISA检测布鲁氏菌感染细胞后培养上清中TGF-β1、IL-1β和IL-18的释放量;Western blot分析TGF-β1蛋白水平的变化。布鲁氏菌侵染重... 建立牛布鲁氏菌2308感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,用RT-qPCR检测感染细胞中TGF-β1在mRNA水平的变化;ELISA检测布鲁氏菌感染细胞后培养上清中TGF-β1、IL-1β和IL-18的释放量;Western blot分析TGF-β1蛋白水平的变化。布鲁氏菌侵染重组外源TGF-β1(rTGF-β1)预孵育的巨噬细胞,检测TGF-β1对炎症因子IL-1β和IL-18的影响。构建布鲁氏菌感染小鼠模型,建模28 d后,将TGF-β1抗体以浓度为1μg/mL的剂量尾根静脉注射感染小鼠,分别在注射TGF-β1后第1天、第15天、第30天收集小鼠外周血,ELISA检测小鼠外周血血清中炎性因子IL-18和IL-1β分泌量。与对照组相比,在细菌侵染细胞前期TGF-β1在转录水平表达上调,而在进入细胞后表达下调,细胞上清中TGF-β1的含量显著升高(P<0.05),且在蛋白水平也出现差异性高表达。预孵育rTGF-β1后布鲁氏菌侵染的巨噬细胞中炎症因子IL-1β和IL-18释放量显著升高(P<0.05)。布鲁氏菌感染小鼠1周~4周后感染组小鼠血清中炎性因子TGF-β1的分泌量显著性低于对照组(P<0.05),在感染第2周后逐步上升。布鲁氏菌感染小鼠后各脏器有明显的病理变化,免疫组化结果显示TGF-β1在脾脏和肝脏中均有不同程度的表达。TGF-β1抗体的注射能够显著性降低布鲁氏菌感染鼠血清中IL-1β和IL-18的分泌(P<0.05),布鲁氏菌感染过程中细胞因子TGF-β1分泌增加,外源性TGF-β1显著增加炎性IL-1β和IL-18的产生,而TGF-β1抗体注射布鲁氏菌感染小鼠可以缓解炎症反应。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 转化生长因子β1(TGF-β1) 炎症因子

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长链非编码RNA在PEDV感染Vero-E6细胞中对自噬的调控作用 被引量：2

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作者 王梓行 邓兴梅 +6 位作者 邱润辉 朱德馨 李佳 陶婷婷 朱嘉乐 孙志华 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1942-1950,共9页

【目的】试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用,以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】根... 【目的】试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用,以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号:NR_047517.1),利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M),并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布。建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型,在0、6、12、24、36和48 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达,以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平。设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段:siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3,分别转染Vero-E6细胞,待细胞汇合度达到90%时接毒,感染48 h后利用实时荧光定量PCR检测lncRNA-M的表达情况,筛选出干扰效率最高的干扰片段。将干扰效率最高的干扰片段转染至Vero-E6细胞并接种PEDV后,通过Western blotting检测感染后24和48 h LC3蛋白的表达水平,以验证自噬的发生情况。【结果】成功筛选出lncRNA-HOTAIR猴源同源序列为lncRNA 0.1,并根据RNAfold预测结果生成lncRNA 0.1的RNA最小自由能二级结构;LncLocator预测结果表明,lncRNA 0.1在细胞核和细胞质中的分布分别为41.88%和37.78%。PEDV感染Vero-E6细胞48 h后,细胞皱缩、聚集成团,细胞膜融合形成合胞体;1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示,在1326 bp处出现目的条带,说明PEDV感染Vero-E6细胞模型成功建立。在PEDV感染的Vero-E6细胞模型中,Western blotting结果显示,6、12、24、36和48 h LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于0 h(P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示,LC3的mRNA表达量在48 h最高,且极显著高于0 h(P<0.01),自噬被激活;lncRNA 0.1的表达均呈上升趋势,在48 h表达量最高,48 h lncRNA 0.1的表达量极显著高于0 h(P<0.01);siRNA-2的干扰效果最好,干扰效率为80%。干扰lncRNA 0.1后,Western blotting结果显示,24和48 h干扰组的LC3蛋白表达量均低于对照组,自噬受到抑制。【结论】PEDV感染Vero-E6细胞能够诱导自噬发生,lncRNA 0.1在感染过程中起到了促进自噬的作用。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 自噬 长链非编码RNA LC3蛋白

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猪轮状病毒VP4基因重组腺病毒的构建及抗体水平评价 被引量：2

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作者 肖莉 牛小杰 +3 位作者 刘庆庆 王月丽 陈创夫 易继海 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期260-269,共10页

【目的】构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列(登录号:MH898990.1)合成PoRV VP4基因,将得... 【目的】构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列(登录号:MH898990.1)合成PoRV VP4基因,将得到的目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行重组,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-VP4;腺病毒穿梭载体经过PmeⅠ内切酶线性化处理后与含有腺病毒骨架pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAd-VP4,对重组质粒进行PacⅠ酶切鉴定,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将重组质粒转染HEK293A细胞获得重组腺病毒rAd-VP4,对该重组腺病毒进行扩大培养并测定重组腺病毒的半数组织培养感染剂量(TCID50);通过RT-PCR检测其体外表达情况,Western blotting检测其反应原性;将制备的重组腺病毒用不同病毒滴度和不同免疫次数对小鼠进行腹腔免疫,收集血清通过ELISA法测定IgG抗体水平。【结果】RT-PCR扩增出1条大小为2343 bp的rAd-VP4重组腺病毒条带,测序结果正确,表明重组腺病毒rAd-VP4构建成功,测得rAd-VP4病毒滴度为106.5TCID50,Western blotting结果表明,重组腺病毒rAd-VP4在蛋白水平上得到了正确表达,蛋白的分子质量约为87 ku。小鼠IgG抗体检测结果表明,在用106.5TCID50rAd-VP4免疫后的第35和42天,小鼠血清中的IgG抗体水平显著高于105.3TCID50TGE-PED-PRV三联活疫苗IgG抗体水平(P<0.05);106.5TCID50rAd-VP4在免疫后第35和42天产生的抗体水平显著高于105.5和104.5TCID50rAd-VP4(P<0.05),而105.5TCID50rAd-VP4在免疫后第28天产生的抗体水平显著高于106.5和104.5TCID50rAd-VP4(P<0.05)。106.5TCID50rAd-VP4的2次免疫和3次免疫产生的IgG抗体在不同免疫时间均差异不显著(P>0.05)。【结论】本研究成功构建了重组腺病毒rAd-VP4,其病毒滴度为106.5TCID50。106.5和105.5TCID50rAd-VP4分别在第42和28天产生较高的IgG抗体水平,2次免疫和3次免疫对产生IgG抗体水平均无显著影响。试验结果可为开发PoRV重组腺病毒候选疫苗提供参考。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(PoRV) 重组腺病毒载体 IGG抗体水平

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布鲁氏菌BPE159基因缺失株的构建及BPE159蛋白对细胞自噬因子表达的影响 被引量：2

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作者 魏春燕 郭嘉 +6 位作者 朱德馨 张伟 朱嘉乐 邓兴梅 贾思锋 刘良波 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期26-36,共11页

【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308... 【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同时间点的生存繁殖能力。【结果】成功构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159和回补株S2308ΔBPE159-C,并可稳定遗传10代。实时荧光定量PCR结果显示,经布鲁氏菌侵染24 h后,与PBS组相比,S2308组中自噬因子ATG5基因表达水平显著降低(P<0.05),Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平极显著降低(P<0.01);与S2308组相比,S2308ΔBPE159组自噬因子Beclin1、LC3a基因表达水平显著升高(P<0.05),ATG5、LC3b基因表达水平极显著升高(P<0.01)。生长曲线结果显示,在相同培养条件下,S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株与S2308株具有相似的生长变化趋势。胞内生存试验结果显示,侵染8 h后,S2308ΔBPE159株在细胞中的数量极显著低于亲本株S2308(P<0.01),12和24 h存活能力显著低于S2308株(P<0.05)。【结论】本研究成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌BPE159基因缺失株和回补株,S2308ΔBPE159株与S2308株生长趋势相似,但生存繁殖能力明显下降;BPE159基因缺失后布鲁氏菌可促进细胞自噬因子的表达,本研究结果为研究布鲁氏菌分泌蛋白的生物学功能和调控机制奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BPE159基因 基因缺失 自噬

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兔源巴氏杆菌分离与鉴定 被引量：6

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作者 韩猛立 张星星 +3 位作者 吴桐忠 郭强强 黄新 钟发刚 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1333-1342,共10页

【目的】研究引起石河子地区某养兔合作社兔不明原因大量死亡的主要病原菌及其耐药性。【方法】采用常规细菌分离培养、形态学观察、生化试验、PCR鉴定及荚膜血清分型、致病性试验、药敏试验明确主要致病菌及其生物学特性。【结果】引... 【目的】研究引起石河子地区某养兔合作社兔不明原因大量死亡的主要病原菌及其耐药性。【方法】采用常规细菌分离培养、形态学观察、生化试验、PCR鉴定及荚膜血清分型、致病性试验、药敏试验明确主要致病菌及其生物学特性。【结果】引起此次疾病的主要病原为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌,且具有较强的致病性,并伴有大肠杆菌混合感染;临床常用的30种抗菌药物中较为敏感的是第三代头孢菌素类如头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟,部分喹诺酮类抗生素如氧氟沙星、左氟沙星以及氟苯尼考等敏感,对其余20余种药物中度敏感或耐药,分离菌株呈现出不同程度的多重耐药性。【结论】荚膜血清A型巴氏杆菌是引起石河子地区兔大规模死亡的主要病原菌,且对临床常用抗菌药物耐药严重;充实了巴氏杆菌在引起该地区引起多种动物疾病的研究基础,为指导临床科学用药和防控提供依据。 展开更多

关键词 兔 多杀性巴氏杆菌 分离鉴定 耐药性

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长链非编码RNA Gm35082-202对布鲁氏菌引起的细胞焦亡的影响 被引量：1

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作者 邓兴梅 曹树珠 +7 位作者 郭嘉 朱德馨 赵天艺 柴迎锦 张伟 史超 贾思锋 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第9期3599-3609,共11页

【目的】研究长链非编码RNA(lncRNA)Gm35082-202对布鲁氏菌侵染引起的细胞焦亡的影响,旨在为研究lncRNA参与布鲁氏菌引起的先天性免疫反应提供参考。【方法】在Ensemble数据库中查找并分析Gm35082-202在染色体上的位置、外显子等信息;采... 【目的】研究长链非编码RNA(lncRNA)Gm35082-202对布鲁氏菌侵染引起的细胞焦亡的影响,旨在为研究lncRNA参与布鲁氏菌引起的先天性免疫反应提供参考。【方法】在Ensemble数据库中查找并分析Gm35082-202在染色体上的位置、外显子等信息;采用RNAfold在线软件预测Gm35082-202的二级结构;通过KEGG、GO富集分析预测Gm35082-202功能;用牛种布鲁氏菌(S2308)以感染复数(MOI)为0.01侵染小鼠巨噬细胞(RAW264.7),在侵染不同时间点(0、4、8、12、24、36、48 h)收集细胞,用实时荧光定量PCR检测Gm35082-202的表达量;利用LncLocator网站预测Gm35082-202亚细胞定位,用实时荧光定量PCR检测Gm35082-202在细胞质、细胞核的表达;将3条Gm35082-202 siRNAs (siRNA1、siRNA2和siRNA3)、siRNA NC转染RAW264.7细胞,实时荧光定量PCR检测Gm35082-202的表达量,筛选干扰效率最高的siRNA进行后续试验。Gm35082-202-siRNA、Gm35082-202-siRNA-NC转染RAW264.7细胞24 h后,再用布鲁氏菌侵染,以PBS为空白对照组(PBS),只用布鲁氏菌侵染的细胞为侵染对照组(Bru)。侵染24 h后收集PBS组、Bru组、Gm35082-202-siRNA组(Bru-siRNA)、Gm35082-202-siRNA-NC组(Bru-NC)细胞,用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测各组细胞中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Caspase-11、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-18的相对表达量,用ELISA法检测各组上清液中细胞因子IL-1β、IL-18分泌水平;通过菌落计数,比较各组布鲁氏菌的胞内生存能力。【结果】基因结构分析表明,Gm35082-202是大小为525 nt的lncRNA(Trianscript ID:ENSMUST00000208164.2),含有2个外显子,位于小鼠7号染色体(Chr7:100 324 295~100 326 967),其二级结构含有多个茎环及多分枝内部环结构;KEGG信号通路富集分析表明,Gm35082-202主要参与NOD样受体、钙调节以及细胞因子信号通路的调控;GO功能分析结果显示,Gm35082-202功能主要涉及DNA转录、线粒体组分以及金属离子结合。布鲁氏菌侵染RAW264.7细胞后,与0 h组相比,侵染4和8 h时Gm35082-202表达量显著增加(P<0.05),侵染12、24、36和48 h时表达量极显著增加(P<0.01);亚细胞定位预测结果表明,Gm35082-202主要分布于细胞核(58.3%),其次是细胞质(35.1%),布鲁氏菌侵染RAW264.7细胞0 h时,Gm35082-202在细胞核中分布比例为63.4%,在侵染4、24和36 h Gm35082-202在细胞核中的分布减少,分别为24.5%、29.6%和30.4%。Gm35082-202-siRNA1、Gm35082-202-siRNA3均极显著降低Gm35082-202的表达量(P<0.01),Gm35082-202-siRNA1干扰效率最高。与Bru组相比,Bru-siRNA组中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、IL-1β和IL-18基因的表达量均极显著降低(P<0.01),NLRP3和Caspase-11蛋白的表达量显著降低(P<0.05),Caspase-1蛋白的表达量极显著降低(P<0.01);细胞上清中IL-1β和IL-18分泌水平均极显著下降(P<0.01);Bru-siRNA组胞内布鲁氏菌数显著升高(P<0.01)。【结论】布鲁氏菌通过上调Gm35082-202表达促进巨噬细胞焦亡,该结果可为进一步探究布鲁氏菌侵染时Gm35082-202参与调控宿主细胞焦亡的分子机制提供参考。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 Gm35082-202 细胞焦亡

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布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的亚细胞定位及与宿主细胞互作蛋白的筛选 被引量：1

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作者 邱润辉 关飞虎 +6 位作者 陶婷婷 李佳 赵天艺 邓兴梅 史超 孙志华 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第4期1438-1448,共11页

【目的】分析布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的蛋白结构及细胞定位,筛选宿主细胞内与其存在相互作用的靶蛋白,为后续研究BPE005的生物学功能奠定基础。【方法】通过生物信息学软件对BPE0005的蛋白结构进行初步分析;构建PDRRED2-C1-BPE005重组... 【目的】分析布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的蛋白结构及细胞定位,筛选宿主细胞内与其存在相互作用的靶蛋白,为后续研究BPE005的生物学功能奠定基础。【方法】通过生物信息学软件对BPE0005的蛋白结构进行初步分析;构建PDRRED2-C1-BPE005重组荧光定位载体,转染人胚肾上皮细胞293T,通过扫描激光共聚焦显微镜观察BPE005的细胞定位;构建PGBKT7-BPE005诱饵载体,验证诱饵载体是否有细胞毒性和自激活现象;以小鼠巨噬细胞RAW264.7 mRNA的cDNA文库为AD文库菌液,检测文库滴度,通过酵母双杂交系统筛选宿主细胞内与BPE005相互作用的靶蛋白。【结果】布鲁氏菌分泌蛋白BPE005属于疏水性蛋白,内含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链。成功构建PDRRED2-C1-BPE005荧光定位载体和PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体,BPE005定位于宿主细胞核。PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体无酵母细胞毒性和自激活现象,AD文库菌液滴度>2×10^(7)/mL,筛选出4个宿主细胞内与BPE0005存在相互作用的蛋白:RNA聚合酶Ⅱ多肽G、补体因子H、鸟苷酸环化酶2G及颗粒蛋白。经复筛、测序、BLAST比对、一对一验证后,最终筛选出1个在宿主细胞内与BPE005具有较强相互作用的靶蛋白(RNA聚合酶Ⅱ多肽G)。对该蛋白的作用网络分析表明,RNA聚合酶Ⅱ多肽G对宿主细胞内mRNA的转录和合成具有重大影响。【结论】布鲁氏菌分泌蛋白BPE005定位于宿主细胞核,在宿主细胞内可与RNA聚合酶Ⅱ多肽G产生较强相互作用,对进一步阐明布鲁氏菌感染过程中关键效应分子的作用机制具有指导意义。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BPE005 亚细胞定位 酵母双杂交

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DDX1影响猪流行性腹泻病毒复制的机制研究

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作者 霍明凯 关飞虎 +4 位作者 邱润辉 魏春燕 于海涛 朱嘉乐 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1556-1566,共11页

【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX 1基因序列(登录号:X... 【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX 1基因序列(登录号:XM_021087822.1),设计特异性引物PCR扩增DDX 1基因全长并连接至pMD19-T克隆载体,双酶切鉴定成功后连接至pcDNA3.1表达载体;连接产物转化后筛选阳性菌落;培养IPI-2I细胞,取传代2次的细胞铺于6孔板内进行后续试验,将阳性菌落的重组质粒转染至6孔板培养24 h后收集蛋白质,Western blotting检测DDX1转染效率;以感染复数(MOI)为1.0的PEDV感染已转染pcDNA3.1-DDX1或PBS(对照)的IPI-2I细胞,建立PEDV感染细胞模型,PEDV感染12 h后分别收集细胞总蛋白质和RNA;间接免疫荧光试验检测细胞水平上PEDV N蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测PEDV N基因mRNA表达水平,Western blotting检测PEDV N蛋白的表达水平;使用生物信息学软件预测DDX1蛋白的磷酸化位点;免疫沉淀试验检测PEDV感染IPI-2I细胞12 h后DDX1的磷酸化水平。【结果】PCR成功扩增得到大小为2223 bp的DDX 1目的基因条带。双酶切鉴定结果显示,成功构建pMD19-T-DDX1克隆载体和pcDNA3.1-DDX1真核表达载体。与PBS组相比,转染pcDNA3.1-DDX1的细胞DDX1蛋白表达水平极显著上升(P<0.01),表明DDX1转染成功。间接免疫荧光试验结果显示,与PBS组相比,PEDV感染组中出现大量绿色荧光信号,表明PEDV感染IPI-2I细胞模型构建成功;与PBS组相比,PEDV N蛋白的荧光信号明显减少,PEDV N基因mRNA表达水平及蛋白表达水平均极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析发现,DDX1蛋白具有多个磷酸化位点,其中包括17个丝氨酸、12个苏氨酸及6个酪氨酸。免疫沉淀试验结果显示,与未感染组相比,PEDV感染组中DDX1磷酸化水平极显著上升(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pcDNA3.1-DDX1真核表达载体,发现PEDV感染IPI-2I细胞12 h后,DDX1抑制了PEDV的复制,升高了磷酸化水平,说明DDX1在PEDV感染期间可能通过磷酸化抑制PEDV的复制。 展开更多

关键词 DDX1 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 磷酸化

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基于RNA-Seq技术分析非致病细胞病变BVDV感染牛单核细胞对NF-κB信号通路的影响 被引量：1

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作者 何延华 马旭升 +4 位作者 钟发刚 黄新 张云峰 赵新霞 陈创夫 《动物医学进展》 北大核心 2020年第2期39-46,共8页

非致细胞病变(NCP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV)可引起持续的潜伏感染和免疫抑制,但是具体的感染机制尚不清楚。采用RNA测序(RNA-seq)技术,以NCP BVDV感染牛单核细胞2h和24h的细胞为样本分别提取总RNA,并采用HiSeqTM2500高通量测序技术进行... 非致细胞病变(NCP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV)可引起持续的潜伏感染和免疫抑制,但是具体的感染机制尚不清楚。采用RNA测序(RNA-seq)技术,以NCP BVDV感染牛单核细胞2h和24h的细胞为样本分别提取总RNA,并采用HiSeqTM2500高通量测序技术进行转录组测序,对获得的有效序列进行功能注释及相关生物信息学分析。结果显示,在感染2h后,筛选出差异表达基因9959个,其中4968基因表达上调;在感染24h后,筛选出差异表达基因7977个,其中4184的基因表达上调;进一步分析NF-κB信号通路的变化,结果显示,在感染后2h,与免疫反应或抗病毒活性相关的基因表达显著增加,到感染24h表达水平显著下降。变化显著的基因均与炎症、免疫、自噬和凋亡密切相关。研究建立的牛外周血单核细胞感染BVDV后差异表达基因数据库,丰富了BVDV与宿主之间的相互关系,为BVDV持续感染机制的研究奠定基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 牛单核细胞 核糖核酸测序 核转录因子-κB信号通路

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