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基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系
1
作者
王楠
杜伟伟
+7 位作者
王婉洁
王悦
袁茂莎
聂雨欣
孙亚茹
刘志国
吴添文
牟玉莲
《中国畜牧兽医》
北大核心
2025年第5期1966-1976,共11页
【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因...
【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因与公猪精液品质性状之间的关系奠定基础。【方法】利用CRISPOR在线网站在猪WIP 1基因g.37536832 C>A位点附近区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX458-GFP载体;通过T7E1酶切试验检测3条sgRNA活性,选择效率较高的sgRNA。构建Donor载体,并将其与sgRNA载体共同转染至ST细胞,采用流式细胞术将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的阳性细胞进行富集和单克隆细胞筛选,并对筛选出的单克隆细胞进行基因型鉴定。【结果】质粒测序结果表明,成功将3条sgRNA连接至pX458-GFP载体上;T7E1酶切结果显示,转染pX458-GFP-sgRNA1和pX458-GFP-sgRNA2质粒组产生了切割,效率分别为24%和27%,而转染pX458-GFP-sgRNA3质粒组未检测到切割,因此选择pX458-GFP-sgRNA2质粒进行试验。成功构建Donor载体,并将pX458-GFP-sgRNA2和Donor载体共转染至ST细胞。基因型鉴定结果显示,获得的269株单克隆中有205株细胞发生了基因编辑,基因编辑效率为76%,其中9株为WIP 1基因g.37536832 C>A位点纯合突变的ST细胞,精确突变效率为3%。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系,为深入研究WIP 1基因对公猪精液品质的影响提供了良好的细胞模型。
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关键词
CRISPR/Cas9
WIP
1基因
ST细胞系
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题名
基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系
1
作者
王楠
杜伟伟
王婉洁
王悦
袁茂莎
聂雨欣
孙亚茹
刘志国
吴添文
牟玉莲
机构
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
中国农业科学院农业基因组研究所
新疆泰裕种猪有限公司
佛山大学生命科学与工程学院
出处
《中国畜牧兽医》
北大核心
2025年第5期1966-1976,共11页
基金
昌吉州丝绸之路经济带创新驱动发展试验区、乌昌石国家自主创新示范区科技发展计划项目(2023112311)
国家自然科学基金项目(32072690)。
文摘
【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因与公猪精液品质性状之间的关系奠定基础。【方法】利用CRISPOR在线网站在猪WIP 1基因g.37536832 C>A位点附近区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX458-GFP载体;通过T7E1酶切试验检测3条sgRNA活性,选择效率较高的sgRNA。构建Donor载体,并将其与sgRNA载体共同转染至ST细胞,采用流式细胞术将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的阳性细胞进行富集和单克隆细胞筛选,并对筛选出的单克隆细胞进行基因型鉴定。【结果】质粒测序结果表明,成功将3条sgRNA连接至pX458-GFP载体上;T7E1酶切结果显示,转染pX458-GFP-sgRNA1和pX458-GFP-sgRNA2质粒组产生了切割,效率分别为24%和27%,而转染pX458-GFP-sgRNA3质粒组未检测到切割,因此选择pX458-GFP-sgRNA2质粒进行试验。成功构建Donor载体,并将pX458-GFP-sgRNA2和Donor载体共转染至ST细胞。基因型鉴定结果显示,获得的269株单克隆中有205株细胞发生了基因编辑,基因编辑效率为76%,其中9株为WIP 1基因g.37536832 C>A位点纯合突变的ST细胞,精确突变效率为3%。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系,为深入研究WIP 1基因对公猪精液品质的影响提供了良好的细胞模型。
关键词
CRISPR/Cas9
WIP
1基因
ST细胞系
Keywords
CRISPR/Cas9
WIP 1 gene
ST cell line
分类号
S828.9 [农业科学—畜牧学]
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作者
出处
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被引量
操作
1
基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系
王楠
杜伟伟
王婉洁
王悦
袁茂莎
聂雨欣
孙亚茹
刘志国
吴添文
牟玉莲
《中国畜牧兽医》
北大核心
2025
0
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