PDE3与亮甲酚蓝在绵羊卵母细胞体外培养中的应用研究 被引量：3

1

作者 汪立芹 王静 +2 位作者 金贤华 陈博 黄俊成 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第25期15408-15409,15553,共3页

[目的]探讨磷酸二酯酶3(PDE3)特异性抑制剂Milrinone与亮甲酚蓝染色液(BCB)相结合在绵羊卵母细胞体外培养中的应用。[方法]比较了BCB对绵羊卵母细胞的筛选与传统的形态分级之间的差异,以及对胚胎后期发育的影响;研究了Milrinone对绵羊... [目的]探讨磷酸二酯酶3(PDE3)特异性抑制剂Milrinone与亮甲酚蓝染色液(BCB)相结合在绵羊卵母细胞体外培养中的应用。[方法]比较了BCB对绵羊卵母细胞的筛选与传统的形态分级之间的差异,以及对胚胎后期发育的影响;研究了Milrinone对绵羊卵母细胞的最佳抑制时间,并用于BCB-卵母细胞体外培养。[结果]A、B级卵母细胞中BCB+卵母细胞的比例为64.42%,极显著高于C级卵母细胞的17.00%;BCB+卵母细胞的成熟率(86.16%)、卵裂率(85.29%)、囊胚率(34.40%)分别极显著高于BCB-卵母细胞(50.94%、36.19%和6.73%);6 h是Milrinone对绵羊卵母细胞的最佳抑制时间,该试验组体外培养效率显著高于其他组;Milrinone对BCB-卵母细胞抑制培养6 h,极显著提高了体外胚胎发育率。[结论]为提高绵羊卵母细胞体外培养效率提供了依据。 展开更多

关键词 磷酸二酯酶3 亮甲酚蓝 MILRINONE 绵羊 卵母细胞

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绵羊类胚胎干细胞长期培养中增殖、凋亡、多能性相关基因的表达动力学 被引量：3

2

作者 周川 赵云程 +4 位作者 林嘉鹏 汪立芹 张秀华 金贤华 黄俊成 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期574-579,共6页

已报道的家畜类胚胎干细胞(embryonic stem-like cell,ESC-like)均无法实现长期培养,这制约了家畜ESC的研究.通过检测本实验室建系的绵羊类胚胎干细胞oESC-like,探究导致oESC-like无法持续培养的原因,为以后的研究打下基础.实验观察了oE... 已报道的家畜类胚胎干细胞(embryonic stem-like cell,ESC-like)均无法实现长期培养,这制约了家畜ESC的研究.通过检测本实验室建系的绵羊类胚胎干细胞oESC-like,探究导致oESC-like无法持续培养的原因,为以后的研究打下基础.实验观察了oESC-like形态变化,检测了AKP的表达,使用免疫荧光技术检测了PCNA、Bcl-2、Bax、Sox-2、Oct-4蛋白的表达,并用软件Image-Pro Plus6.0计算蛋白表达水平.结果显示,oESC-like在长期培养过程中其形态具备ESC的典型形态特征;AKP持续表达;Sox-2和Oct-4的表达有不同程度的提高,增殖能力无明显变化;Bax表达水平逐代提高,Bcl-2的表达水平在5、10代显著高于Bax的表达水平可抑制Bax的活化,而从15代开始Bcl-2表达水平下降,低于Bax的表达水平,不能有效地抑制Bax的活化;Bcl-2/Bax表达水平的比值逐代下降,说明oESC-like在长期培养过程中逐渐走向凋亡.为解决绵羊类胚胎干细胞能够体外长期培养的科学问题,针对本实验室已有研究成果和存在的问题,进行逆向思维找出突破口,为遗传育种、基因工程、医疗等方面在实践上提供理论基础. 展开更多

关键词 胚胎干细胞 绵羊 凋亡 多能性

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IGF-Ι对绵羊冷冻精液质量的影响 被引量：1

3

作者 林嘉鹏 唐淑红 +2 位作者 吴阳升 汪立芹 黄俊成 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期498-502,共5页

【目的】探讨冻精稀释液中添加类胰岛素生长因子-I(IGF-Ι)对绵羊冷冻精液质量的影响,明确最佳的IGF-Ι添加浓度,为提高绵羊冻精受精率和加速其品种改良奠定基础。【方法】以特克赛尔年轻种公羊的精液为试验材料,在冻精稀释液中添加不... 【目的】探讨冻精稀释液中添加类胰岛素生长因子-I(IGF-Ι)对绵羊冷冻精液质量的影响,明确最佳的IGF-Ι添加浓度,为提高绵羊冻精受精率和加速其品种改良奠定基础。【方法】以特克赛尔年轻种公羊的精液为试验材料,在冻精稀释液中添加不同浓度(0、50、100、150和250 ng/m L)的IGF-Ι,通过SYBR-14/PI双染法、低渗肿胀试验和吖啶橙(AO)染色法检测解冻精液在孵育0、1和2 h后的顶体完整性、质膜完整性和DNA完整性,并通过体外培养验证其体外受精效果。【结果】Ⅱ组(IGF-Ι添加浓度100 ng/m L)的冷冻精液解冻孵育0、1和2 h后,其精子顶体完整性呈逐渐下降趋势,但整体效果优于其他试验组;在精子质膜完整性和DNA完整性方面,也表现为Ⅱ组高于其他试验组,且孵育时间越短(1 h内),效果差异越明显,均显著高于对照组(P<0.05)。体外受精试验结果显示,5个试验组间的卵裂率和囊胚发育率均不存在显著差异(P>0.05),但以Ⅱ组的体外受精效果略优于其他试验组。【结论】绵羊冻精稀释液中添加IGF-I可有效增强精子活力,改善冻精存活率,维持顶体、质膜和DNA完整性,但要求绵羊冷冻精液须在解冻后1 h内完成相关操作。 展开更多

关键词 绵羊 冷冻精液 稀释液 IGF-Ι 顶体完整性 质膜完整性 DNA完整性

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卵周隙内注射慢病毒生产转基因绵羊的方法 被引量：1

4

作者 汪立芹 刘晨曦 +1 位作者 王静 黄俊成 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2011年第1期12-15,F0003,共5页

目的提高并稳定转基因绵羊生产效率。方法采用卵周隙内注射慢病毒的方法生产转基因绵羊。比较了不同发育阶段卵母细胞注射慢病毒对其后期发育及基因表达的影响,对照了注射不同慢病毒剂量以及不同熟练程度人员操作,对胚胎发育及基因表达... 目的提高并稳定转基因绵羊生产效率。方法采用卵周隙内注射慢病毒的方法生产转基因绵羊。比较了不同发育阶段卵母细胞注射慢病毒对其后期发育及基因表达的影响,对照了注射不同慢病毒剂量以及不同熟练程度人员操作,对胚胎发育及基因表达率的影响。结果 (1)受精前或受精后注射慢病毒对胚胎后期发育和阳性率没有影响(P>0.05);(2)在受精后的单细胞注射或者2～4细胞期注射慢病毒对胚胎后期发育和阳性率也都没有影响(P>0.05);(3)慢病毒注射剂量在50～100 pL之间对转基因效率没有影响(P>0.05);(4)操作人员的熟练程度不影响胚胎成活率和转基因效率(P>0.05)。结论建立了卵周隙内注射慢病毒生产转基因绵羊的方法,并使转基因胚胎阳性率稳定在70%以上。 展开更多

关键词 转基因 慢病毒 绵羊卵母细胞

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bFGF培养体系中添加不同因子对绵羊类胚胎干细胞多能性的影响 被引量：1

5

作者 张秀华 赵云程 +4 位作者 林嘉鹏 汪立芹 周川 石庆华 黄俊成 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第4期797-803,共7页

为筛选出能够维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like)多能性的因子,以oESC-like为材料,在N2B27/CH/bFGF培养体系中,分别加入PD、PD/hLIF、PD/BPM4、PD/hLIF/BMP4,培养细胞8 d,分析绵羊类胚胎干细胞多能性,确定最适培养体系。结果显示:在N2B27/... 为筛选出能够维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like)多能性的因子,以oESC-like为材料,在N2B27/CH/bFGF培养体系中,分别加入PD、PD/hLIF、PD/BPM4、PD/hLIF/BMP4,培养细胞8 d,分析绵羊类胚胎干细胞多能性,确定最适培养体系。结果显示:在N2B27/CH/bFGF培养体系添加PD或PD/hLIF后,oESC-like细胞生长较好;所有培养液中oESC-like细胞的AKP染色及多能性候选基因Sox2和Oct4免疫荧光蛋白染色结果均呈阳性;添加PD后,多能性候选基因Oct4与Klf4 mRNA的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),Nestin与Lin28的表达量显著降低(P<0.01),Sox2与c-Myc升高但差异不显著。添加PD/hLIF后,Oct4的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),c-Myc、Klf4、Lin28表达量升高但不显著,Nestin和Sox2表达量降低但也不显著。以上结果表明:在oESC-like培养体系中,添加PD或PD/hLIF可能有利于维持绵羊类胚胎干细胞的多能性。 展开更多

关键词 绵羊类胚胎干细胞 多能性调控因子 体外培养 候选基因

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不同电融合参数及融合液对昆明小鼠2-细胞胚胎融合及囊胚率的影响 被引量：1

6

作者 周川 赵云程 黄俊成 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第5期56-59,共4页

四倍体胚胎在研究哺乳动物配子发生、发育、四倍体的发生、遗传、免疫机制等方面具有重要作用,因此提高融合及发育效率至关重要。为找出适合小鼠2-细胞胚胎融合的最佳方案,试验采用两种融合液0.3mol/L甘露醇溶液和0.3mol/L蔗糖溶液,两... 四倍体胚胎在研究哺乳动物配子发生、发育、四倍体的发生、遗传、免疫机制等方面具有重要作用,因此提高融合及发育效率至关重要。为找出适合小鼠2-细胞胚胎融合的最佳方案,试验采用两种融合液0.3mol/L甘露醇溶液和0.3mol/L蔗糖溶液,两种融合液均采用了120V/mm,20μs×2、100V/mm,40μs×2、80V/mm,80μs×2三种电融合参数。其中采用0.3mol/L甘露醇溶液作为融合液且融合参数采用80V/mm,80μs×2获得了92.5%的融合率和90.6%的囊胚率,是小鼠2-细胞胚胎融合的最佳方案。 展开更多

关键词 四倍体胚胎 电融合 发育

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供核细胞及处理方式对绵羊核移植效率的影响

7

作者 汪立芹 王静 +2 位作者 赵云程 林嘉鹏 黄俊成 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2012年第B12期69-73,共5页

旨在研究羔羊、胎儿成纤维细胞、绵羊类胚胎干细胞及处理方式对核移植效率的影响。比较了羔羊皮肤成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;胎儿成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;羔羊成纤维细胞、胎儿成纤... 旨在研究羔羊、胎儿成纤维细胞、绵羊类胚胎干细胞及处理方式对核移植效率的影响。比较了羔羊皮肤成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;胎儿成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;羔羊成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、类胚胎干细胞在可用率及对融合率的差异和类胚胎干细胞与转基因羔羊皮肤成纤维细胞对核移植效率的影响。结果表明,饥饿对胎儿成纤维细胞可用率影响不大(P>0.05),但平衡时间影响极大(P<0.01);饥饿及平衡时间对胎儿成纤维细胞影响都很显著(P<0.01);胎儿成纤维细胞的可用率极显著高于类胚胎干细胞和羔羊皮肤成纤维细胞(P<0.01),融合率显著高于羔羊(P<0.05),但与类胚胎干细胞间没有差异(P>0.05);胚胎移植后,类胚胎干细胞的怀孕率显著高于羔羊皮肤成纤维细胞(P<0.05)。饥饿和平衡时间对供核细胞的可用率有显著影响,类胚胎干细胞的核移植效果好于成纤维细胞。 展开更多

关键词 核移植 成纤维细胞 类胚胎干细胞 饥饿 平衡时间

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bFGF浓度对oESC-like增值、凋亡、多能性相关基因表达的影响

8

作者 周川 赵云程 +4 位作者 汪立芹 林嘉鹏 金贤华 张秀华 黄俊成 《生物学杂志》 CAS CSCD 2012年第5期1-5,共5页

使用免疫荧光技术检测与增值、凋亡、多能性相关基因的表达水平。提高bFGF浓度可增强PCNA、Oct-4、Sox-2、Bax和Bcl-2的表达,同时使Bcl-2/Bax比值维持较稳定水平。结果表明提高bFGF浓度可增强oESC-like的增值能力和多能性,增强其抗凋亡... 使用免疫荧光技术检测与增值、凋亡、多能性相关基因的表达水平。提高bFGF浓度可增强PCNA、Oct-4、Sox-2、Bax和Bcl-2的表达,同时使Bcl-2/Bax比值维持较稳定水平。结果表明提高bFGF浓度可增强oESC-like的增值能力和多能性,增强其抗凋亡能力以适应长期培养。 展开更多

关键词 胚胎干细胞 绵羊 多能性 碱性成纤维细胞生长因子

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添加不同因子对绵羊类胚胎干细胞多能性的影响

9

作者 张秀华 石庆华 +5 位作者 赵云程 林嘉鹏 汪立芹 周川 金贤华 黄俊成 《中国草食动物》 CAS 2012年第3期25-29,共5页

为筛选出更有利于维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like cell)多能性的因子,在基础培养基N2B27/CH中,分别添加PD、PD+hLIF、PD+BPM4、PD+hLIF+BMP4,通过比较分析,初步筛选出了比本实验室原培养体系(N2B27/CH+bFGF)更利于维持oESC-like多能性... 为筛选出更有利于维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like cell)多能性的因子,在基础培养基N2B27/CH中,分别添加PD、PD+hLIF、PD+BPM4、PD+hLIF+BMP4,通过比较分析,初步筛选出了比本实验室原培养体系(N2B27/CH+bFGF)更利于维持oESC-like多能性的培养基添加因子。结果显示:基础培养基中添加PD、PD+hLIF后细胞生长较好,细胞之间的结合更加致密;各种培养基培养物都表达AKP与Sox2、Oct4免疫荧光蛋白等oESC-like多能性标志;4种不同培养基与bFGF相比,细胞的生长速度减慢;在基础培养基N2B27/CH中添加PD和PD+hLIF使多能性候选基因Lin28与c-Myc表达量极显著升高(P<0.01),Nestin的表达量极显著下调(P<0.01),加入PD+hLIF使Oct4表达量极显著上调(P<0.01)。因此,在oESC-like基础培养液N2B27/CH的基础上,添加PD或PD+hLIF更有利于oESC-like细胞多能性维持。 展开更多

关键词 绵羊类胚胎干细胞 体外培养 多能性调控因子 候选基因

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7个shRNA分子对绵羊BMPR-1B基因的干扰作用分析

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作者 金贤华 林嘉鹏 +5 位作者 白杰 刘晨曦 汪立芹 阿米娜 周川 黄俊成 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第3期586-592,共7页

为获得有效干扰绵羊BMPR-1B基因的shRNA干扰分子,从绵羊卵巢组织中扩增了1 515 bp BMPR-1B基因全长编码区cDNA序列,添加HA标签序列后,插入Plex-mcs慢病毒质粒,构建Plex-BMPR-1B慢病毒表达载体,转染HEK293细胞,并与2个包装质粒共转染293... 为获得有效干扰绵羊BMPR-1B基因的shRNA干扰分子,从绵羊卵巢组织中扩增了1 515 bp BMPR-1B基因全长编码区cDNA序列,添加HA标签序列后,插入Plex-mcs慢病毒质粒,构建Plex-BMPR-1B慢病毒表达载体,转染HEK293细胞,并与2个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,用获得的重组慢病毒感染HEK293细胞;同时,将7个干扰分子与Pll-LentiLox 3.7载体重组,并与3个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,获得干扰分子的重组病毒颗粒。最后用干扰分子重组的病毒颗粒感染整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞,进行qRT-PCR和Western blot检测。结果显示:重组BMPR-1B蛋白质在稳定整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞系中获得了表达;研究中设计的7个shRNA分子能抑制绵羊BMPR-1B基因表达水平68.30%～99.86%,其中PLL-BMPR-1B-1306和PLL-BMPR-1B-1475干扰分子的干扰效果最好。 展开更多

关键词 BMPR-1B基因 SHRNA HEK293细胞 慢病毒

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不同因素对绵羊卵母细胞体外受精效果的影响 被引量：5

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作者 汪立芹 赵云程 +5 位作者 陈童 陈世彬 左北瑶 彭夏雨 黄俊成 郭志勤 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第8期84-87,共4页

本试验研究了发情羊血清、不同个体的冷冻精液和新鲜精液、精子密度、受精时颗粒细胞的有无及不同培养液对绵羊体外受精效果的影响。结果表明,发情3d的血清与发情当天的血清相比,对卵裂率和囊胚率有极显著的影响(P<0.01);不同个体的... 本试验研究了发情羊血清、不同个体的冷冻精液和新鲜精液、精子密度、受精时颗粒细胞的有无及不同培养液对绵羊体外受精效果的影响。结果表明,发情3d的血清与发情当天的血清相比,对卵裂率和囊胚率有极显著的影响(P<0.01);不同个体的冷冻精子对卵裂率和囊胚率都有显著的影响(P<0.05),但鲜精和冷冻精子的受精效果与个体有关;精子密度在2×106～6×106个/mL之间对受精效果没有影响(P>0.05);颗粒细胞对受精的作用不明显(P>0.05);不同的培养液对受精效果没有显著影响(P>0.05)。因此,选用好的公羊个体精子,用发情3d的发情羊血清能显著提高受精效果。 展开更多

关键词 绵羊 体外受精 发情血清 卵裂率 囊胚率

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不同因素对北山羊-山羊核移植重构胚融合率的影响 被引量：1

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作者 杨梅 汪立芹 +2 位作者 陈童 彭夏雨 郭志勤 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第9期158-161,共4页

作者通过对融合方式、融合场强、体细胞与透明带切口位置及重构后是否修复等条件对北山羊—山羊体细胞核移植重构胚融合率的影响进行了研究。结果表明,不同融合方式能显著影响融合率(67.57%和42.15%,P<0.05);场强在1.3～1.9 kV/cm范... 作者通过对融合方式、融合场强、体细胞与透明带切口位置及重构后是否修复等条件对北山羊—山羊体细胞核移植重构胚融合率的影响进行了研究。结果表明,不同融合方式能显著影响融合率(67.57%和42.15%,P<0.05);场强在1.3～1.9 kV/cm范围内对融合率和死亡率都没有影响;体细胞在透明带的切口处对融合率影响不显著,但融合过程中死亡率高于对照组(8.25%和2.3%,P>0.05);重构后立即融合与修复2 h后再融合对融合率没有影响(67.29%和68.33%,P>0.05)。 展开更多

关键词 北山羊 山羊 核移植 融合率

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影响转基因绵羊胚胎移植受胎率的因素 被引量：5

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作者 汪立芹 陈童 +1 位作者 林嘉鹏 黄俊成 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期6-9,共4页

为了提高并稳定转基因胚胎移植受胎率,对可能影响受胎率的供受体同期化程度、移植胚胎数量、受体处理方式、胚胎发育速度、受体注射黄体酮、供体作受体等6个方面进行研究。结果表明,(1)供受体发情时间差在±12h以内,不影响受胎率(P&... 为了提高并稳定转基因胚胎移植受胎率,对可能影响受胎率的供受体同期化程度、移植胚胎数量、受体处理方式、胚胎发育速度、受体注射黄体酮、供体作受体等6个方面进行研究。结果表明,(1)供受体发情时间差在±12h以内,不影响受胎率(P>0.05);(2)每只受体移植2～3枚转基因胚胎的受胎率极显著高于移植1枚的受胎率(P<0.01);(3)在繁殖季节里,受体采用自然发情、肌肉注射PGF2α、肌肉注射PMSG+PGF2α等方式,三者受胎率间差异不显著(P>0.05);(4)发育迟缓的胚胎移植后,受胎率显著低于正常发育胚胎的受胎率(P<0.01);(5)移植后的受体注射2mg黄体酮,不能提高受胎率(P>0.05);(6)供体当作受体使用,不影响受胎率(P>0.05)。 展开更多

关键词 绵羊 转基因 胚胎移植 受胎率

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绵羊Follistatin基因不同功能区片段的原核表达与纯化

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作者 阿米乃.亚日 冉多良 +1 位作者 李文蓉 张宁 《中国草食动物科学》 CAS 2012年第4期5-8,共4页

为了研究绵羊Follistatin基因的功能及与MSTN的结合能力,克隆了FS结构域1及结构域2,构建了405 bp插入序列的原核表达重组质粒pET-FS N+D1,以及630 bp插入序列的pET-FSN+D1+D2。通过SDS-PAGE及Western blot检验,在IPTG诱导表达。结果显示... 为了研究绵羊Follistatin基因的功能及与MSTN的结合能力,克隆了FS结构域1及结构域2,构建了405 bp插入序列的原核表达重组质粒pET-FS N+D1,以及630 bp插入序列的pET-FSN+D1+D2。通过SDS-PAGE及Western blot检验,在IPTG诱导表达。结果显示:分别获得了带有6×His的45 kDa和51 kDa融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式存在。经His亲和层析分别纯化了pET-FSN+D1,pET-FSN+D1+D2,目的蛋白含量分别达2.58μg/mL和5.98μg/mL,为进一步研究Follistatin基因的功能及与MSTN的结合能力提供了基础。 展开更多

关键词 绵羊 FOLLISTATIN 结构域 原核表达 纯化

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