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棉花基因编辑标记基因GhOMT1和GhPGF高效sgRNA的筛选
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作者 郭浩猛 代培红 +3 位作者 张锦恩 张国帅 雷建峰 刘晓东 《棉花学报》 北大核心 2025年第2期153-164,共12页
【目的】筛选棉花类黄酮O-甲基转移酶编码基因GhOMT1和腺体形成相关基因GhPGF编辑的单链引导RNA(single guide RNA,sg RNA),为快速检测突变体植株奠定基础。【方法】基于Cas9蛋白超表达棉花材料Jin668,设计能够靶向敲除GhOMT1和Gh PGF... 【目的】筛选棉花类黄酮O-甲基转移酶编码基因GhOMT1和腺体形成相关基因GhPGF编辑的单链引导RNA(single guide RNA,sg RNA),为快速检测突变体植株奠定基础。【方法】基于Cas9蛋白超表达棉花材料Jin668,设计能够靶向敲除GhOMT1和Gh PGF基因的sg RNA。利用棉花叶皱缩病毒(cotton leaf crumple virus,CLCr V)载体介导的基因编辑、高通量突变追踪(high-throughput tracking of mutations,Hi-TOM)等技术,检测sg RNA的编辑效率和特异性。【结果】GhOMT1-sg RNA2和GhPGF-sg RNA可分别导致Gh OMT1和Gh PGF基因在靶位点处产生突变。Hi-TOM测序结果表明,转化GhOMT1-sg RNA2的15株棉花中有12株发生了突变,突变效率为80%;转化单株在A、D亚基因组上的编辑效率分别为7.90%~43.72%、9.60%~56.32%。Gh PGF-sg RNA的突变效率为80%,基因编辑效率为10.23%~30.27%。GhOMT1-sg RNA2的3个潜在脱靶位点均未发现脱靶现象;Gh PGF-sg RNA在基因组编码区无潜在脱靶位点。说明这2个sg RNA不仅可以靶向敲除靶基因,而且具有专一性。【结论】利用CLCr V介导的基因编辑系统筛选出1个能靶向敲除Gh OMT1的sg RNA和1个能靶向敲除GhPGF的sg RNA。 展开更多
关键词 棉花 标记基因 GhOMT1 GhPGF 棉花叶皱缩病毒 sg RNA 特异性
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GhALMT10在干旱胁迫下的功能鉴定
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作者 马鑫 雷建峰 +4 位作者 黄诗雨 张国帅 郭浩猛 李月 代培红 《棉花学报》 北大核心 2025年第3期175-184,共10页
【目的】探究铝激活苹果酸转运蛋白(aluminum-activated malate transporter,ALMT)家族基因GhALMT10在棉花抗旱过程中的生物学功能,为深入了解棉花抗旱机制奠定基础。【方法】通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)从陆地... 【目的】探究铝激活苹果酸转运蛋白(aluminum-activated malate transporter,ALMT)家族基因GhALMT10在棉花抗旱过程中的生物学功能,为深入了解棉花抗旱机制奠定基础。【方法】通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)从陆地棉TM-1扩增GhALMT10基因编码序列,并进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测该基因在棉花不同组织部位和干旱胁迫下的表达模式。通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术,初步验证了该基因在棉花响应干旱胁迫中发挥的生物学功能。【结果】GhALMT10基因编码区长度为1401 bp,编码1个包含466个氨基酸残基的蛋白,预测其为稳定、疏水蛋白。系统进化分析表明GhALMT10与GrALMT10、GaALMT10-like、HsALMT10和TcALMT10亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,该基因在棉花根、茎、叶中都有表达,且在根中的表达量最高。与清水处理相比,干旱胁迫处理3 h该基因的表达量较低,6 h、9 h的表达量显著升高,24 h的表达量显著降低。与阴性对照棉株相比,GhALMT10基因沉默棉株在干旱胁迫下的存活率显著提高,离体叶片失水率显著降低,叶片的叶绿素含量显著升高而丙二醛含量显著降低。【结论】GhALMT10基因沉默棉株对干旱胁迫的耐受能力显著提高,GhALMT10基因负调控棉花抗旱性。 展开更多
关键词 棉花 GhALMT10 干旱胁迫 表达模式分析 病毒诱导的基因沉默 生理生化指标
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