大豆gma-miR1514b生物信息学分析及人工microRNA植物表达载体构建 被引量：3

1

作者 倪志勇 于月华 +1 位作者 陈全家 曲延英 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期46-51,共6页

MicroRNAs在植物发育与逆境响应等多个方面具有重要的调节作用。本研究采用生物信息学方法分析gmamiR1514b的靶基因和启动子中的顺式作用元件。PLACE和Plant CARE启动子在线预测工具分析表明gma-miR1514b启动子序列具有TATA-box、CAAT-... MicroRNAs在植物发育与逆境响应等多个方面具有重要的调节作用。本研究采用生物信息学方法分析gmamiR1514b的靶基因和启动子中的顺式作用元件。PLACE和Plant CARE启动子在线预测工具分析表明gma-miR1514b启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的顺式作用元件和一些参与光、逆境和植物激素应答相关的顺式作用元件。PMRD软件预测获得5个gma-miR1514b靶基因,分别与拟南芥CA2、NTL9和ANAC014基因同源。通过重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiR1514b前体的植物表达载体amiR1514b-p CAMBIA3301。 展开更多

关键词 大豆 gma-miR1514b amiRNA 启动子

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棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定 被引量：14

2

作者 雷建峰 李月 +4 位作者 徐新霞 阿尔祖古丽.塔什 蒲艳 张巨松 刘晓东 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期675-683,共9页

U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166 bp),采用Transfer PCR方法成功地截出6个... U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166 bp),采用Transfer PCR方法成功地截出6个长度不同的U6启动子,其长度分别为672、468、358、280、202和105 bp,并分别构建了6个启动子驱动的GUS融合植物表达载体。将构建好的6个GbU6-5Ps::GUS-pCAMBIA1300与初始克隆的GbU6-5P::GUS-pCAMBIA1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS组织化学染色显示,克隆到的7个不同截短大小的GbU6-5P启动子均能驱动GUS基因在棉花花粉中转录,棉花花粉被染成蓝色但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短,其转录活性越高。而且另外两种棉花U6启动子GbU6-1P和GbU6-7P也表现出类似的结果。本研究克隆了3个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的GbU6启动子。结果显示更短的U6启动子具有更高的转录活性,而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。这预示着使用更短U6启动子不仅符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求,而且会提高sgRNA的转录水平,进而可能提高基因组编辑效率。 展开更多

关键词 棉花 GbU6启动子 截短克隆 真空渗透 棉花花粉

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基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立 被引量：12

3

作者 李继洋 雷建峰 +5 位作者 代培红 姚瑞 曲延英 陈全家 李月 刘晓东 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期227-235,共9页

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具,目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子,分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因... CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具,目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子,分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料,制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sg RNA和CAMV35S::Cas9两部分),并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR,成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序,结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主,少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能,为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。 展开更多

关键词 棉花 原生质体 CRISPR/Cas9 基因组编辑

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棉花GhMYB146基因克隆及亚细胞定位分析 被引量：6

4

作者 倪志勇 邱迎风 +3 位作者 加得拉.吐留汗 于月华 陈全家 曲延英 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期2119-2126,共8页

MYB转录因子是发育、代谢、生物和非生物胁迫应答调控网络中的关键因子。为了分析棉花Gh MYB146转录因子的亚细胞定位,通过RT-PCR和RACE方法从棉花纤维中克隆了1个棉花MYB转录因子Gh MYB146的c DNA序列,采用生物信息学方法分析了Gh MYB... MYB转录因子是发育、代谢、生物和非生物胁迫应答调控网络中的关键因子。为了分析棉花Gh MYB146转录因子的亚细胞定位,通过RT-PCR和RACE方法从棉花纤维中克隆了1个棉花MYB转录因子Gh MYB146的c DNA序列,采用生物信息学方法分析了Gh MYB146的氨基酸序列,构建了Gh MYB146基因的亚细胞定位载体并进行了亚细胞定位分析。结果表明,克隆的R2R3-MYB基因Gh MYB146的c DNA全长1 027 bp,开放阅读框长879 bp,编码292个氨基酸,蛋白质预测分子量约为33.151 k D,等电点为7.9;推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域;Gh MYB146基因组包含3个外显子和2个内含子。进化树分析表明,Gh MYB146和Gh MYB5分为一个分支;亚细胞定位结果表明,Gh MYB146:GFP融合蛋白定位于细胞核中。本试验结果为进一步研究Gh MYB146基因的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 棉花 GhMYB146 克隆 亚细胞定位

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不同截短U3启动子在棉花中的功能分析 被引量：3

5

作者 雷建峰 徐新霞 +3 位作者 代培红 李继洋 张巨松 刘晓东 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2016年第3期307-314,共8页

从海岛棉中克隆了2种GbU3-2P、GbU3-3P启动子,对它们进行2种长度截短,长度分别为436、245 bp和384、233 bp,同时构建了4个相应启动子驱动GUS的融合植物表达载体。利用农杆菌真空渗透转化法将4个GbU3Ps∷GUS-sg RNA-P1300植物表达载体分... 从海岛棉中克隆了2种GbU3-2P、GbU3-3P启动子,对它们进行2种长度截短,长度分别为436、245 bp和384、233 bp,同时构建了4个相应启动子驱动GUS的融合植物表达载体。利用农杆菌真空渗透转化法将4个GbU3Ps∷GUS-sg RNA-P1300植物表达载体分别转染棉花胚性愈伤组织。经GUS组织化学染色显示:克隆得到的2种截短大小的GbU3-2P和GbU3-3P启动子均能驱动GUS基因在棉花愈伤组织中表达,棉花愈伤组织被染成蓝色,但颜色深浅没有显著差异。本研究表明,同一GbU3启动子截短后,较短的启动子和较长的启动子具有相同的转录活性。这为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了更多理想的启动子。 展开更多

关键词 棉花 GbU3启动子 截短克隆 真空渗透 愈伤组织

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基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究 被引量：4

6

作者 李继洋 胡燕 +2 位作者 姚瑞 代培红 刘晓东 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1522-1534,共13页

CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这... CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明,2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。 展开更多

关键词 棉花 CRISPR/Cas9 编辑效率 脱靶效率 sgRNA类型

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海岛棉GbWRKY40基因的克隆及特征分析 被引量：3

7

作者 倪志勇 加得拉.吐留汗 +2 位作者 邱迎风 曲延英 陈全家 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期393-400,共8页

【目的】WRKY转录因子调控多种生物学进程,包括植物生长发育和应答多种环境胁迫。本研究旨在分析WRKY转录因子在海岛棉纤维发育中的功能。【方法】从海岛棉中克隆了1个WRKY转录因子基因GbWRKY40,进行同源性分析、多序列比对,利用荧光定... 【目的】WRKY转录因子调控多种生物学进程,包括植物生长发育和应答多种环境胁迫。本研究旨在分析WRKY转录因子在海岛棉纤维发育中的功能。【方法】从海岛棉中克隆了1个WRKY转录因子基因GbWRKY40,进行同源性分析、多序列比对,利用荧光定量聚合酶链式反应分析其表达模式,通过构建酵母表达载体并转化酵母菌株AH109研究其转录激活活性。【结果】该基因c DNA全长1713 bp,5'非编码区长261 bp,3'非编码区长510 bp;开放阅读框长942 bp,编码313个氨基酸,预测相对分子质量约为34.138×103,等电点为8.46,包含5个外显子和4个内含子;其编码蛋白含有1个WRKY保守区(WRKYGQK)和1个锌指基序(C-X5-C-X23-H-X1-H),属于WRKY家族第Ⅱ类a组,包含3个核定位信号区,与陆地棉GhWRKY40同源性最高。GbWRKY40在根和开花后25 d纤维中表达量高,而且不具有转录激活活性。【结论】GbWRKY40可能参与调控棉纤维次生壁发育。 展开更多

关键词 海岛棉 GbWRKY40 表达模式 基因克隆 转录激活

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大豆gma-miR1508a靶基因鉴定及植物表达载体构建 被引量：1

8

作者 倪志勇 于月华 +2 位作者 任燕萍 陈全家 曲延英 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期1090-1092,共3页

MicroRNAs是内源的非编码小RNA分子,在植物生长、发育和逆境响应过程中具有重要的调控功能。本研究采用5'RLM-RACE方法鉴定了大豆gma-miR1508a的1个靶基因Glyma16g27800。为了构建gma-miR1508a的过表达载体,使用烟草花叶病毒组成型... MicroRNAs是内源的非编码小RNA分子,在植物生长、发育和逆境响应过程中具有重要的调控功能。本研究采用5'RLM-RACE方法鉴定了大豆gma-miR1508a的1个靶基因Glyma16g27800。为了构建gma-miR1508a的过表达载体,使用烟草花叶病毒组成型启动子35S控制gma-miR1508a的过表达,采用PCR方法从大豆基因组DNA中扩增了101 bp含有折回结构的前体序列,扩增片段被亚克隆至p CAMBIA3301载体中,PCR和测序结果表明gma-miR1508a植物表达载体构建成功。 展开更多

关键词 大豆 gma-miR1508a 靶基因 植物表达载体

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通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能 被引量：5

9

作者 李玉霞 曲延英 +4 位作者 艾海提·艾合买提 王慧敏 黄启秀 陈琴 陈全家 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2020年第1期1-10,共10页

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同... 【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照<GbF3’H单基因沉默组<3种基因共沉默组,说明共沉默材料对枯萎病的抗性明显低于单基因沉默材料,单基因沉默材料明显低于空载体对照和野生型。【结论】初步确定GbF3’H基因对提高海岛棉枯萎病抗性有一定作用,且可与Gb CHI、GbDFR基因协同作用增强抗病性,这可为海岛棉功能基因组学研究提供参考。 展开更多

关键词 海岛棉 GbF3’H 枯萎病抗性 病毒诱导的基因沉默(VIGS) 共沉默 实时荧光定量聚合酶链式反应

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陆地棉GhMYB9基因克隆及结合特性分析 被引量：7

10

作者 邱迎风 倪志勇 +2 位作者 刘娜 陈全家 曲延英 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期440-446,共7页

MYB转录因子蛋白普遍存在于植物中,广泛参与植物的生长发育和代谢调控。为研究GhMYB9基因对棉纤维的调控机制,使用PCR方法,从棉花中克隆1个R2R3-MYB基因GhMYB9(Gen Bank登录号:AF336286.1);利用生物信息学方法分析其氨基酸序列;构建酵... MYB转录因子蛋白普遍存在于植物中,广泛参与植物的生长发育和代谢调控。为研究GhMYB9基因对棉纤维的调控机制,使用PCR方法,从棉花中克隆1个R2R3-MYB基因GhMYB9(Gen Bank登录号:AF336286.1);利用生物信息学方法分析其氨基酸序列;构建酵母表达载体。结果表明,该基因c DNA全长1 145 bp,开放阅读框长795 bp,编码264个氨基酸,预测其蛋白分子量约为29.624 k D,等电点为9.13。推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB9基因组包含2个外显子和1个内含子。进化树分析表明,GhMYB9和Gh MYB聚在同一分支(HQ234875.1)。酵母单杂交试验结果表明,GhMYB9转录因子能够特异结合AC顺式作用元件。本研究结果为进一步阐明GhMYB9的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 棉花 GhMYB9 克隆 酵母单杂交

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棉花U3和U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定 被引量：2

11

作者 藏旭阳 代培红 +3 位作者 李继洋 蒲艳 顾爱星 刘晓东 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2019年第1期31-39,共9页

【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基... 【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。 展开更多

关键词 棉花 CRISPR/Cas9 基因组编辑 U3/U6启动子 原生质体

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薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达 被引量：5

12

作者 龚林涛 苏秀娟 +4 位作者 尹松松 孙明辉 闫博文 阿迪莱·阿布都热依木 陈全家 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1233-1242,共10页

【目的】研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】(1)薰衣草DXS... 【目的】研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】(1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。 展开更多

关键词 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 克隆 基因表达 原核表达

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农杆菌介导的bar基因和Bt基因的遗传转化研究 被引量：1

13

作者 孟灵真 陈全家 +3 位作者 杨婷 阿依夏木.古丽 王希东 曲延英 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期2189-2196,共8页

【目的】探讨不同基因对不同棉花品种的遗传转化差异。【方法】以新海14号、新海16号、新海24号和新海30号四个不同基因型海岛棉胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法分别将pBI121-bar/Bt和pBI121-Bt转化至四个品种中,对遗传转化体... 【目的】探讨不同基因对不同棉花品种的遗传转化差异。【方法】以新海14号、新海16号、新海24号和新海30号四个不同基因型海岛棉胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法分别将pBI121-bar/Bt和pBI121-Bt转化至四个品种中,对遗传转化体系中的PPT浓度和Cef浓度进行筛选,观察比较不同浓度下不同基因型胚性愈伤的生长状况,并对单价表达载体和双价表达载体转化不同基因型胚性愈伤的生长状态进行比较。【结果】转化体系的筛选确定双价表达载体的PPT筛选浓度为3.0 mg/L,Cef的筛选浓度为800 mg/L;转化单价表达载体LBA4404/pBI121-Bt的Cef的筛选浓度为600 mg/L。转化单价表达载体后,新海14号的出愈率最高,新海30号的出愈率最低;转化双价表达载体后,新海14号的出愈率最高,新海24号的出愈率最低。【结论】不同基因型对PPT的敏感性有差异;转化不同基因后,胚性愈伤对抗生素的敏感度有所不同;转化相同基因后,不同品种的胚性愈伤生长存在差异。 展开更多

关键词 PPT Cef基因型 胚性愈伤组织 遗传转化

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拟南芥rd29A启动子的克隆及植物表达载体构建 被引量：1

14

作者 申丽婕 于月华 +6 位作者 刘娜 梁承娟 汪晓东 谷月好 崔雪 张振清 倪志勇 《湖北农业科学》 2016年第18期4824-4826,共3页

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA为材料,根据Gen Bank中拟南芥rd29A启动子序列设计引物,采用PCR克隆一段长度为951 bp的rd29A启动子序列。采用Plant CARE启动子在线预测工具分析表明,rd29A启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基... 以拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA为材料,根据Gen Bank中拟南芥rd29A启动子序列设计引物,采用PCR克隆一段长度为951 bp的rd29A启动子序列。采用Plant CARE启动子在线预测工具分析表明,rd29A启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的顺式作用元件和1个脱落酸应答元件(ABRE)和2个脱水应答调控元件(DRE)。将rd29A启动子序列亚克隆到pcambia3301载体的多克隆位点,构建了由rd29A启动子驱动的植物表达载体。 展开更多

关键词 拟南芥(Arabidopsis thaliana) RD29A 启动子 植物表达载体

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