【目的】通过研究猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PCV2)感染过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligands,PD-Ls)信号通路作用,寻找调节PCV2免疫抑制新途径,减少...【目的】通过研究猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PCV2)感染过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligands,PD-Ls)信号通路作用,寻找调节PCV2免疫抑制新途径,减少PCV2感染造成的经济损失。【方法】利用实验室构建的重组表达宿主菌pET32a-PD1/Rosetta(DE)进行诱导表达、纯化,获得猪可溶性PD-1蛋白(soluble PD-1,sPD-1)的诱导表达条件;制备大量具有活性的猪sPD-1蛋白,体外作用于PCV2感染的猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),分别通过CCK-8和流式细胞术检测PBMCs的增殖情况,间接免疫荧光法和RT-qPCR检测猪sPD-1蛋白对PCV2病毒载量的影响,RT-qPCR和ELISA检测猪sPD-1蛋白对免疫相关细胞因子IL-2、IL-12、IL-21、IL-17A和IFN-γ等的转录水平和分泌水平的影响。【结果】通过诱导表达、纯化获得了高纯度、高活性的重组猪sPD-1蛋白。与未使用猪sPD-1蛋白处理的PCV2感染PBMCs组相比,10μg·mL−1猪sPD-1蛋白处理的猪PCV2病毒载量下降至1000 copies·μL−1以下;CCK-8检测结果显示猪sPD-1蛋白处理组细胞增殖指数显著提高(P<0.05);流式细胞术检测发现猪sPD-1蛋白组的平均荧光强度为(68.60±10.14)%,相对于PCV2病毒组(28.70±3.18)%显著增强(P<0.05);反转录荧光定量PCR和ELISA检测,发现猪sPD-1蛋白处理组的细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的转录水平和分泌水平显著升高(P<0.05)。【结论】猪sPD-1蛋白可以通过阻断PD-1/PD-Ls通路降低PCV2的病毒载量,促进PBMCs的增殖,增强PBMCs细胞因子的转录水平和分泌水平免疫反应。因此,猪sPD-1蛋白在体外可以增强PCV2感染PBMCs的免疫反应,进一步为病毒性疾病的防控提供理论依据。展开更多
[目的]研究微小RNA let-7a(microRNA let-7a,miR-let-7a)对脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)诱导的炎性奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)的增殖和凋亡作用。[方法]通过实时荧光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-P...[目的]研究微小RNA let-7a(microRNA let-7a,miR-let-7a)对脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)诱导的炎性奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)的增殖和凋亡作用。[方法]通过实时荧光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、实时细胞分析仪和流式细胞术检测过表达和抑制表达miR-let-7a在炎性MAC-T中的影响。[结果]qRT-PCR检测结果显示,转染miR-let-7a模拟物会使炎性MAC-T细胞中miR-let-7a的表达量极显著上调(P<0.001),转染miR-let-7a抑制剂会使细胞中miR-let-7a的表达量极显著下降(P<0.001);RTCA结果显示,转染miR-let-7a模拟物能明显促进MAC-T细胞增殖,转染miR-let-7a抑制物会使MAC-T细胞的增殖受到抑制;流式细胞术结果显示,转染miR-let-7a模拟物的MAC-T细胞的凋亡率显著降低(P<0.01);而转染miR-let-7a抑制剂则与之相反,MAC-T细胞的凋亡率显著升高(P<0.01)。即过表达miR-let-7a可以促进MAC-T细胞增殖,并降低细胞的凋亡率。而抑制表达miR-let-7a的作用与之相反,抑制表达miR-let-7a使MAC-T细胞的增殖下降,细胞的凋亡率增大。[结论]miR-let-7a是一种抑制炎症调节因子,其过表达可以缓解奶牛乳腺炎,为阐明奶牛乳腺炎的分子调控机制奠定基础。展开更多
文摘【目的】通过研究猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PCV2)感染过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligands,PD-Ls)信号通路作用,寻找调节PCV2免疫抑制新途径,减少PCV2感染造成的经济损失。【方法】利用实验室构建的重组表达宿主菌pET32a-PD1/Rosetta(DE)进行诱导表达、纯化,获得猪可溶性PD-1蛋白(soluble PD-1,sPD-1)的诱导表达条件;制备大量具有活性的猪sPD-1蛋白,体外作用于PCV2感染的猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),分别通过CCK-8和流式细胞术检测PBMCs的增殖情况,间接免疫荧光法和RT-qPCR检测猪sPD-1蛋白对PCV2病毒载量的影响,RT-qPCR和ELISA检测猪sPD-1蛋白对免疫相关细胞因子IL-2、IL-12、IL-21、IL-17A和IFN-γ等的转录水平和分泌水平的影响。【结果】通过诱导表达、纯化获得了高纯度、高活性的重组猪sPD-1蛋白。与未使用猪sPD-1蛋白处理的PCV2感染PBMCs组相比,10μg·mL−1猪sPD-1蛋白处理的猪PCV2病毒载量下降至1000 copies·μL−1以下;CCK-8检测结果显示猪sPD-1蛋白处理组细胞增殖指数显著提高(P<0.05);流式细胞术检测发现猪sPD-1蛋白组的平均荧光强度为(68.60±10.14)%,相对于PCV2病毒组(28.70±3.18)%显著增强(P<0.05);反转录荧光定量PCR和ELISA检测,发现猪sPD-1蛋白处理组的细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的转录水平和分泌水平显著升高(P<0.05)。【结论】猪sPD-1蛋白可以通过阻断PD-1/PD-Ls通路降低PCV2的病毒载量,促进PBMCs的增殖,增强PBMCs细胞因子的转录水平和分泌水平免疫反应。因此,猪sPD-1蛋白在体外可以增强PCV2感染PBMCs的免疫反应,进一步为病毒性疾病的防控提供理论依据。
文摘[目的]研究微小RNA let-7a(microRNA let-7a,miR-let-7a)对脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)诱导的炎性奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)的增殖和凋亡作用。[方法]通过实时荧光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、实时细胞分析仪和流式细胞术检测过表达和抑制表达miR-let-7a在炎性MAC-T中的影响。[结果]qRT-PCR检测结果显示,转染miR-let-7a模拟物会使炎性MAC-T细胞中miR-let-7a的表达量极显著上调(P<0.001),转染miR-let-7a抑制剂会使细胞中miR-let-7a的表达量极显著下降(P<0.001);RTCA结果显示,转染miR-let-7a模拟物能明显促进MAC-T细胞增殖,转染miR-let-7a抑制物会使MAC-T细胞的增殖受到抑制;流式细胞术结果显示,转染miR-let-7a模拟物的MAC-T细胞的凋亡率显著降低(P<0.01);而转染miR-let-7a抑制剂则与之相反,MAC-T细胞的凋亡率显著升高(P<0.01)。即过表达miR-let-7a可以促进MAC-T细胞增殖,并降低细胞的凋亡率。而抑制表达miR-let-7a的作用与之相反,抑制表达miR-let-7a使MAC-T细胞的增殖下降,细胞的凋亡率增大。[结论]miR-let-7a是一种抑制炎症调节因子,其过表达可以缓解奶牛乳腺炎,为阐明奶牛乳腺炎的分子调控机制奠定基础。
