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人A组轮状病毒VP6蛋白的原核表达及其小鼠多克隆抗体的制备 被引量:1
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作者 张卫斌 吕长坤 +2 位作者 杨颖 王向鹏 王明永 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第9期910-916,共7页
目的表达和纯化人A组轮状病毒VP6蛋白,制备小鼠抗VP6蛋白多克隆抗体。方法通过RT-PCR方法从人A组轮状病毒感染的粪便标本中扩增VP6基因,构建pET-32a-VP6原核表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞;用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖... 目的表达和纯化人A组轮状病毒VP6蛋白,制备小鼠抗VP6蛋白多克隆抗体。方法通过RT-PCR方法从人A组轮状病毒感染的粪便标本中扩增VP6基因,构建pET-32a-VP6原核表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞;用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导VP6表达,采用镍柱(Ni-NTA)亲和层析纯化VP6蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting鉴定VP6蛋白;将VP6蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体滴度。结果构建了pET32a-VP6重组表达质粒,VP6蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析法纯化了VP6蛋白,免疫小鼠后获得了多克隆抗体,抗体效价为1∶32000,抗体可以和VP6蛋白发生特异性反应。结论表达和纯化了人A组轮状病毒的VP6蛋白,制备了小鼠抗VP6蛋白的多克隆抗体,为人A组轮状病毒诊断抗原的制备和血清学检测方法的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 人A组轮状病毒 VP6蛋白 原核表达 多克隆抗体
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GBP3依赖其GTP酶活性负向调控HTLV-1病毒复制
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作者 刘燕子 赵鑫 +5 位作者 秦潇 黄雨璐 杨曦 范晴晴 杨波 王洁 《中国免疫学杂志》 北大核心 2025年第3期535-539,共5页
目的:探讨GBP3对成人T淋巴细胞白血病1型病毒(HTLV-1)复制的影响。方法:采用Western blot检测HTLV-1感染的HeLa细胞和THP1细胞中GBP3的表达量;在THP1和HeLa细胞中通过siRNA沉默GBP3,Western blot验证GBP3敲低效率;过表达GBP3或敲减GBP3... 目的:探讨GBP3对成人T淋巴细胞白血病1型病毒(HTLV-1)复制的影响。方法:采用Western blot检测HTLV-1感染的HeLa细胞和THP1细胞中GBP3的表达量;在THP1和HeLa细胞中通过siRNA沉默GBP3,Western blot验证GBP3敲低效率;过表达GBP3或敲减GBP3后,采用RT-qPCR和Western blot检测HTLV-1感染细胞中前病毒转录本Tax、px、HBZ、Gag、ENV、5´UTR和病毒蛋白Tax和p19蛋白的表达量;构建失去GTP酶活性的GBP3的突变体GBP3K51A,检测GBP3对HTLV-1感染的调控是否依赖于GBP3的GTP酶活性。结果:HTLV-1感染的HeLa和THP1细胞中GBP3表达上升;GBP3过表达可导致HTLV-1的前病毒转录本和病毒蛋白表达量下降,siRNA敲减GBP3则具有相反的效果,GBP3K51A过表达可导致HTLV-1前病毒转录本和病毒蛋白表达量增加。结论:HTLV-1病毒感染可诱导GBP3表达;GBP3过表达抑制病毒复制,可能依赖GTP酶活性。 展开更多
关键词 GBP3 HTLV-1 抗病毒 GTP酶活性
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人A组轮状病毒VP6蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 张卫斌 吕长坤 +2 位作者 杨颖 王明永 王向鹏 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第9期932-938,共7页
目的建立基于人A组轮状病毒(Rotavirus group A,RVA)VP6蛋白的间接ELISA抗体检测方法,为RVA抗体检测提供技术支持。方法以RVA的VP6蛋白为诊断抗原,用棋盘滴定方法优化ELISA反应条件,建立检测RVA抗体的间接ELISA方法。收集健康儿童血清和... 目的建立基于人A组轮状病毒(Rotavirus group A,RVA)VP6蛋白的间接ELISA抗体检测方法,为RVA抗体检测提供技术支持。方法以RVA的VP6蛋白为诊断抗原,用棋盘滴定方法优化ELISA反应条件,建立检测RVA抗体的间接ELISA方法。收集健康儿童血清和RVA患者血清,用建立的方法检测血清标本。结果以2µg/mL的VP6蛋白包被酶标板,血清1∶250倍稀释为最佳条件,阴阳性临界值为0.137。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,与Western blotting抗体检测方法符合率为95%。检测370份儿童血清标本,抗体阳性率为81.1%。检测15名RVA患者的急性期和恢复期血清,恢复期血清中RVA抗体滴度相比于急性感染期明显增高。结论建立的ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于RVA抗体检测和RVA感染的辅助诊断。 展开更多
关键词 人A组轮状病毒 VP6蛋白 间接酶联免疫吸附试验 抗体检测
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ATPIF1通过调节糖酵解能力影响CAR-NK92细胞抗肿瘤活性研究
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作者 刘彪 龚雪 +2 位作者 胡璧梁 郭春磊 钟根深 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第10期865-874,共10页
目的探究ATP合酶抑制因子1(ATPIF1)对于嵌合抗原受体(CAR)-NK92细胞抗肿瘤活性的影响。方法构建靶向HER2的ATPIF1过表达和敲低的CAR-NK92细胞;流式细胞术检查CAR阳性表达率;CCK-8法检测细胞增殖能力;Seahorse分析细胞糖酵解能力;线粒体... 目的探究ATP合酶抑制因子1(ATPIF1)对于嵌合抗原受体(CAR)-NK92细胞抗肿瘤活性的影响。方法构建靶向HER2的ATPIF1过表达和敲低的CAR-NK92细胞;流式细胞术检查CAR阳性表达率;CCK-8法检测细胞增殖能力;Seahorse分析细胞糖酵解能力;线粒体膜电位探针(JC-1)法检测细胞线粒体膜电位水平;萤火虫荧光素酶报告基因检测法检测靶细胞裂解率;流式细胞术检测细胞CD107a、自然杀伤细胞组2成员D(NKG2D)、颗粒酶B(GzmB)、穿孔素(perforin)、白细胞介素2(IL-2)表达水平;实时荧光定量PCR检测细胞干扰素诱导蛋白与四肽重复1(IFIT1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、ATPIF1、己糖激酶1(HK1)表达;2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)抑制糖酵解,检测对CAR-NK92细胞抗肿瘤能力影响。结果成功制备靶向HER2的对照组CAR-NK92细胞以及ATPIF1过表达和敲低表达的CAR-NK92细胞;ATPIF1过表达的CAR-NK92细胞靶细胞裂解率、NKG2D和CD107a的表达水平、GzmB和IL-2分泌能力、IFIT1和TNF-α的mRNA表达水平显著上调,ATPIF1敲低表达后结果相反。ATPIF1过表达引起CAR-NK92细胞代谢重编程,线粒体膜电位(Δψm)显著降低,HK1的mRNA表达水平显著上调,基础糖酵解和糖酵解能力增强。2-DG(5μmol/L)抑制糖酵解后,ATPIF1过表达和敲低表达的CAR-NK92细胞与对照组相比,NKG2D和CD107a表达水平无显著差异。结论ATPIF1通过调节糖酵解代谢能力来影响CAR-NK92细胞抗肿瘤活性,通过过表达ATPIF1可以增强CAR-NK92细胞的抗肿瘤活性。 展开更多
关键词 CAR-NK NK92 ATPIF1 糖酵解 肿瘤
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二甲双胍与三氧化二砷对KG1a细胞增殖的抑制作用 被引量:2
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作者 黄李文惠 刘萌 +4 位作者 桂淑敏 冯明明 刘慧 司晓慧 牛新清 《中国实验血液学杂志》 CSCD 北大核心 2024年第1期66-70,共5页
目的:探讨二甲双胍协同三氧化二砷对急性髓系白血病KG1a细胞增殖的影响及其可能的机制。方法:采用CCK-8法检测二甲双胍、三氧化二砷以及联合应用对KG1a细胞的杀伤作用;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测应用二甲双胍协同三氧化二砷... 目的:探讨二甲双胍协同三氧化二砷对急性髓系白血病KG1a细胞增殖的影响及其可能的机制。方法:采用CCK-8法检测二甲双胍、三氧化二砷以及联合应用对KG1a细胞的杀伤作用;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测应用二甲双胍协同三氧化二砷对KG1a细胞凋亡的影响;Western blot检测胞内凋亡、自噬相关蛋白的表达。结果:二甲双胍与三氧化二砷联合及单独应用均可抑制KG1a细胞增殖,诱导KG1a细胞凋亡,联合用药组增殖抑制率及凋亡率高于单独用药组(P<0.05)。联合用药诱导KG1a细胞中Caspase 8和P62蛋白表达上调且高于单药组(P<0.05)。结论:二甲双胍能协同三氧化二砷杀伤KG1a细胞,其作用机制可能与诱导凋亡和增强自噬有关。 展开更多
关键词 三氧化二砷 二甲双胍 急性髓系白血病 Caspase 8 P62
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SLAMF7在小鼠肠道组织及肠道炎症中的表达及意义
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作者 杨燕 陆雪珂 +2 位作者 葛秀珍 娄运伟 常廷民 《协和医学杂志》 CSCD 北大核心 2024年第4期831-838,共8页
目的探讨细胞表面受体信号淋巴细胞激活分子家族成员7(signaling lymphocytic activation molecule family member 7,SLAMF7)在小鼠肠道正常组织和炎症组织中的表达及意义。方法选择8~10周龄C57BL/6J野生型(wild-type)雄性小鼠5只,正常... 目的探讨细胞表面受体信号淋巴细胞激活分子家族成员7(signaling lymphocytic activation molecule family member 7,SLAMF7)在小鼠肠道正常组织和炎症组织中的表达及意义。方法选择8~10周龄C57BL/6J野生型(wild-type)雄性小鼠5只,正常饮用水喂养,提取其结肠固有层淋巴细胞(lamina propria lymphocytes,LPLs)和肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs),Trizol试剂提取细胞总RNA,逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测细胞中SLAMF7的mRNA表达情况。选择8~10周龄C57BL/6J野生型雄性小鼠10只,随机分为对照组和模型组,每组各5只。对照组用正常饮用水喂养,模型组用含2.5%葡聚糖硫酸酯钠盐(dextran sodium sulfate,DSS)的饮用水喂养,建立小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型。于喂养第5天处死两组小鼠,采用流式细胞术检测对照组与模型组SLAMF7在免疫细胞亚群中的表达情况。结果相较于结肠IECs,SLAMF7在结肠LPLs中表达显著升高(P=0.017);DSS诱导肠炎后,SLAMF7在中性粒细胞中的表达上调(P=0.001),在CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、巨噬细胞、经典树突状细胞(conventional dendritic cells,cDCs)中的表达无明显变化(P均>0.05)。结论SLAMF7可能通过中性粒细胞相关途径在UC的发生发展过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 炎症性肠病 溃疡性结肠炎 固有层淋巴细胞 SLAMF7
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高脂饮食条件下极长链饱和脂肪酸对大鼠认知功能的影响及相关机制 被引量:2
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作者 赵舒祥 杨磊 +7 位作者 张李娟 王若溪 韩琪 陈路路 张伟 高璐璐 李文强 石如玲 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1209-1217,共9页
目的:探讨高脂饮食条件下极长链饱和脂肪酸(VLCSFA)对大鼠认知功能的影响及相关机制。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为5组,每组10只,即空白对照组组(饲喂基础饲料)、低含量对照(L-CON)组(饲喂20%对照用油)、低含量VLCSFA(L-VLC)组(饲喂20... 目的:探讨高脂饮食条件下极长链饱和脂肪酸(VLCSFA)对大鼠认知功能的影响及相关机制。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为5组,每组10只,即空白对照组组(饲喂基础饲料)、低含量对照(L-CON)组(饲喂20%对照用油)、低含量VLCSFA(L-VLC)组(饲喂20%实验用油)、高含量对照(H-CON)组(饲喂30%对照用油)和高含量VLCSFA(H-VLC)组(饲喂30%实验用油),饲喂12周。Morris水迷宫测定大鼠学习记忆能力;气相色谱法检测脑皮质脂肪酸组成及含量;生化法检测脑氧化应激水平;ELISA法检测脑促炎因子水平;Western blot法检测脑中β-分泌酶(BACE1)、α-分泌酶(ADAM10)、磷酸化tau蛋白及细胞凋亡相关蛋白的水平。结果:与L-CON组相比,LVLC组大鼠穿越平台次数显著减少(P<0.05),脑皮质C21:0、C22:0、C23:0、C24:0、C26:0和ΣVLCSFA含量显著增加(P<0.05或P<0.01),ADAM10蛋白水平显著下降(P<0.01),BACE1和p-tau396蛋白水平显著升高(P<0.05),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低(P<0.01),丙二醛(MDA)水平显著升高(P<0.05),白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平显著升高(P<0.01);与H-CON组相比,H-VLC组大鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.05),脑皮质C20:0、C21:0、C22:0、C23:0、C24:0、C26:0和ΣVLCSFA含量均显著升高(P<0.05或P<0.01),ADAM10蛋白水平显著下降(P<0.01),BACE1、p-tau396和p-tau404蛋白水平显著升高(P<0.01),超氧化物歧化酶(SOD)和GSHPx活性显著降低(P<0.05或P<0.01),MDA水平显著升高(P<0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.01),B细胞淋巴瘤/白血病蛋白2(Bcl-2)水平显著降低(P<0.05),Bcl-2相关X蛋白(Bax)和cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:通过高脂饮食大量摄入VLCSFA会损害大脑认知功能,其机制可能与脑组织VLCSFA积累增多、淀粉样前体蛋白代谢、tau蛋白过度磷酸化、氧化应激、神经炎症和细胞凋亡有关。 展开更多
关键词 阿尔茨海默病 极长链饱和脂肪酸 TAU蛋白过度磷酸化 氧化应激 神经炎症 细胞凋亡
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T细胞活力响应性启动子(TARP)萤光素酶报告系统在CAR⁃T细胞功能鉴定中的应用
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作者 梁思辛 郑瑞 +5 位作者 赵晓娟 张仪婷 王鹏举 蒙若彤 阎博 杨安钢 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期397-403,共7页
目的将T细胞活力响应性启动子(TARP)纳米萤光素酶报告基因系统导入含有嵌合抗原受体(CAR)编码基因的慢病毒质粒中,为CAR⁃T细胞活化水平及功能鉴定提供一种便捷的、定量分析的方案。方法采用全基因合成及分子克隆技术构建重组质粒。慢病... 目的将T细胞活力响应性启动子(TARP)纳米萤光素酶报告基因系统导入含有嵌合抗原受体(CAR)编码基因的慢病毒质粒中,为CAR⁃T细胞活化水平及功能鉴定提供一种便捷的、定量分析的方案。方法采用全基因合成及分子克隆技术构建重组质粒。慢病毒包装并感染人原代T淋巴细胞,流式细胞术检测慢病毒感染T细胞的阳性率。通过萤光素酶报告基因系统、Western blot法、流式细胞术、小动物活体成像技术鉴定CAR⁃T细胞的功能。结果酶切鉴定和质粒测序结果表明重组质粒的顺利构建,流式细胞术结果显示CAR⁃T细胞的正常制备,萤光素酶活力检测结果表明本系统能够动态响应CAR⁃T细胞的激活,体外功能实验证实本系统能够反映CAR⁃T细胞的耗竭状态,小动物活体成像结果体现了本系统在小鼠体内的示踪功能。结论TARP纳米萤光素酶报告基因系统为评估CAR⁃T细胞活化水平,耗竭状态以及体内示踪等方面提供了更加便捷、灵敏、定量分析的技术手段。 展开更多
关键词 T细胞活力响应性启动子(TARP) 萤光素酶报告基因系统 嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR⁃T cells)
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