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慢病毒载体介导稳定表达Cpf1的细胞系的构建及其基因编辑效率验证
1
作者
覃鸿妮
谢钰珍
+3 位作者
陈罡
密苗苗
彭赛男
张勇
《西南农业学报》
CSCD
北大核心
2020年第2期246-251,共6页
【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、...
【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT108002-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。
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关键词
CRISPR/Cpf1
慢病毒载体
细胞系
基因编辑
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职称材料
石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法的建立
被引量：
3
2
作者
翟伟锋
殷波
《南方农业》
2017年第32期67-69,共3页
利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立一种方便、快捷的石斑鱼神经坏死病毒(NNV)检测方法。根据石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列的保守区设计5组特异引物,提取斜带石斑鱼的总RNA,利用RT-LAMP技术比较5组引物的敏感性和特异性...
利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立一种方便、快捷的石斑鱼神经坏死病毒(NNV)检测方法。根据石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列的保守区设计5组特异引物,提取斜带石斑鱼的总RNA,利用RT-LAMP技术比较5组引物的敏感性和特异性,同时对反应温度和反应时间进行优化,并对现场20尾鱼苗进行了检测。结果表明:筛选出一组高特异性的引物,在61℃条件下恒温反应20 min可以完成检测;在反应试管中添加钙黄绿素,可利用荧光反应现象进行结果判定,且对9种常见鱼类病原微生物无交叉反应;对20尾鱼苗进行了现场检测,检测结果与RT-PCR结果一致。本研究成功建立起石斑鱼神经坏死病毒RT-LAMP检测方法,方法特异性强、反应时间短、操作简单,为进一步推广该技术在现场大规模的应用奠定了研究基础。
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关键词
石斑鱼
神经坏死病毒
RT-LAMP
检测方法
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职称材料
NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其应用
被引量：
2
3
作者
朱建蕊
翟伟锋
《南方农业》
2018年第6期112-114,共3页
为获得稳定表达及较好免疫效力的重组NNV衣壳蛋白,对已公布的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列进行优化,并构建表达载体p ET32a-NNV,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导、表达,将包涵体纯化后碾磨成粉添加到黄粉虫饲料中,用虫体粉末喂食石斑...
为获得稳定表达及较好免疫效力的重组NNV衣壳蛋白,对已公布的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列进行优化,并构建表达载体p ET32a-NNV,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导、表达,将包涵体纯化后碾磨成粉添加到黄粉虫饲料中,用虫体粉末喂食石斑鱼,攻毒保护试验检测免疫效力。结果获得高表达的NNV衣壳蛋白包涵体,目的蛋白占总蛋白的比率达70%,纯化后纯度达95%;且喂食本技术制备的黄粉虫粉末后石斑鱼对NNV抵抗力显著提高,存活率由5%上升至83%。本研究提供一种重组NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中高效表达和纯化方法,为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推广奠定了基础。
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关键词
石斑鱼
神经坏死病毒
衣壳蛋白
疫苗
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职称材料
题名
慢病毒载体介导稳定表达Cpf1的细胞系的构建及其基因编辑效率验证
1
作者
覃鸿妮
谢钰珍
陈罡
密苗苗
彭赛男
张勇
机构
苏州
工业园区服务外包职业学院
金唯智
生物科技
有限公司
斯
澳
生物科技
(
苏州
)
有限公司
出处
《西南农业学报》
CSCD
北大核心
2020年第2期246-251,共6页
基金
江苏省高等学校自然科学研究面上项目(18KJ D180005)
江苏省高职院校教师专业带头人高端研究项目(2019GRFX093)
江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目(201814295006Y)。
文摘
【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT108002-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。
关键词
CRISPR/Cpf1
慢病毒载体
细胞系
基因编辑
Keywords
CRISPR/Cpf1
Lentiviral vector
Cell line
Gene editing
分类号
S154.32 [农业科学—土壤学]
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职称材料
题名
石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法的建立
被引量：
3
2
作者
翟伟锋
殷波
机构
斯
澳
生物科技
(
苏州
)
有限公司
苏州
工业园区新国大研究院
生物
工程与
生物
医学中心
出处
《南方农业》
2017年第32期67-69,共3页
基金
厦门南方海洋研究中心项目(项目编号:14GZP75NF39)
闽海洋高新[2014]21号
江苏省自然科学基金(项目编号:BK20160373)
文摘
利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立一种方便、快捷的石斑鱼神经坏死病毒(NNV)检测方法。根据石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列的保守区设计5组特异引物,提取斜带石斑鱼的总RNA,利用RT-LAMP技术比较5组引物的敏感性和特异性,同时对反应温度和反应时间进行优化,并对现场20尾鱼苗进行了检测。结果表明:筛选出一组高特异性的引物,在61℃条件下恒温反应20 min可以完成检测;在反应试管中添加钙黄绿素,可利用荧光反应现象进行结果判定,且对9种常见鱼类病原微生物无交叉反应;对20尾鱼苗进行了现场检测,检测结果与RT-PCR结果一致。本研究成功建立起石斑鱼神经坏死病毒RT-LAMP检测方法,方法特异性强、反应时间短、操作简单,为进一步推广该技术在现场大规模的应用奠定了研究基础。
关键词
石斑鱼
神经坏死病毒
RT-LAMP
检测方法
分类号
S943 [农业科学—水产养殖]
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职称材料
题名
NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其应用
被引量：
2
3
作者
朱建蕊
翟伟锋
机构
斯
澳
生物科技
(
苏州
)
有限公司
西安交通大学医学部药学院
苏州
工业园区新国大研究院
生物
工程与
生物
医学中心
出处
《南方农业》
2018年第6期112-114,共3页
基金
厦门南方海洋研究中心项目
14GZP75NF39
闽海洋高新[2014]21号
文摘
为获得稳定表达及较好免疫效力的重组NNV衣壳蛋白,对已公布的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列进行优化,并构建表达载体p ET32a-NNV,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导、表达,将包涵体纯化后碾磨成粉添加到黄粉虫饲料中,用虫体粉末喂食石斑鱼,攻毒保护试验检测免疫效力。结果获得高表达的NNV衣壳蛋白包涵体,目的蛋白占总蛋白的比率达70%,纯化后纯度达95%;且喂食本技术制备的黄粉虫粉末后石斑鱼对NNV抵抗力显著提高,存活率由5%上升至83%。本研究提供一种重组NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中高效表达和纯化方法,为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推广奠定了基础。
关键词
石斑鱼
神经坏死病毒
衣壳蛋白
疫苗
分类号
S943 [农业科学—水产养殖]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
慢病毒载体介导稳定表达Cpf1的细胞系的构建及其基因编辑效率验证
覃鸿妮
谢钰珍
陈罡
密苗苗
彭赛男
张勇
《西南农业学报》
CSCD
北大核心
2020
0
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法的建立
翟伟锋
殷波
《南方农业》
2017
3
在线阅读
下载PDF
职称材料
3
NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其应用
朱建蕊
翟伟锋
《南方农业》
2018
2
在线阅读
下载PDF
职称材料
已选择
0
条
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引用分析
参考文献
引证文献
统计分析
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