牛病毒性腹泻病毒E2截短基因重组卡介苗安全性和最佳免疫剂量的研究 被引量：1

1

作者 杨宇航 李晶 +6 位作者 张云 郝俊伟 刘东旭 时坤 李健明 曾范利 杜锐 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第7期34-37,共4页

将6组BVDV-E2截短基因重组卡介苗用生理盐水稀释,分别进行革兰染色和伊红美蓝平板检测,6组重组卡介苗均无杂菌污染。再对6周龄～8周龄雄性豚鼠进行免疫接种,每只腹腔注射1mL（5×106 cfu/只）,免疫接种豚鼠无任何症状,精神、食欲、... 将6组BVDV-E2截短基因重组卡介苗用生理盐水稀释,分别进行革兰染色和伊红美蓝平板检测,6组重组卡介苗均无杂菌污染。再对6周龄～8周龄雄性豚鼠进行免疫接种,每只腹腔注射1mL（5×106 cfu/只）,免疫接种豚鼠无任何症状,精神、食欲、排便及发育等均不受影响,且无死亡,说明重组病毒对试验豚鼠是安全的。使用BVDV抗体检测试剂盒对60头健康牛的母源抗体含量进行检测,不含母源抗体占85.00%。取重组卡介苗中的一组,用生理盐水稀释,使重组卡介苗达到105、106、107、108、109 cfu/mL共5组,每组不含母源抗体的牛3头,免疫接种前对每头牛进行尾颈静脉采血,析出血清,用BVDV抗体检测试剂盒测牛血清中抗体水平。采完血后对牛进行皮下免疫接种,4周后,采取血液,检测牛血清中抗体水平。通过免疫接种后的检测结果可知,重组疫苗对牛最佳免疫剂量为108 cfu/mL,为进一步进行重组疫苗回归本动物的免疫效果研究提供了可靠依据。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2截短基因 重组卡介苗 最佳免疫剂量 安全性

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水貂阿留申病毒VP2蛋白Dot-ELISA检测方法的建立 被引量：4

2

作者 李晶 时坤 +4 位作者 曾范利 张妍 孙凡婷 刘杨 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期619-622,共4页

为建立一种适合于基层快速检测水貂阿留申病毒(ADV)的检测方法,本研究将ADV的VP2基因经重叠延伸PCR法进行扩增后克隆至表达载体p GEX-4T-1中进行原核表达,将纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了ADV的Dot-ELISA检测方法,并与对流免疫电泳(C... 为建立一种适合于基层快速检测水貂阿留申病毒(ADV)的检测方法,本研究将ADV的VP2基因经重叠延伸PCR法进行扩增后克隆至表达载体p GEX-4T-1中进行原核表达,将纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了ADV的Dot-ELISA检测方法,并与对流免疫电泳(CIEP)作对照试验。结果表明,抗原最适包被浓度为20μg/m L,最适血清稀释度为1∶200,酶标二抗最适工作浓度为1∶2 000,血清和酶标抗体最适反应温度为37℃,反应时间为45 min^60 min。阻断试验和交叉试验显示与常见的貂病毒性肠炎和貂犬瘟热阳性血清无交叉反应,表明其具有良好的特异性。采用建立的Dot-ELISA和CIEP对78份临床血清样品进行检测,结果显示Dot-ELISA阳性检出率为84.6%,CIEP的阳性检出率为80.8%,敏感性高于CIEP,两者符合率为96.2%。本研究建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速、灵敏、特异、重复性好,适合基层单位用于水貂阿留申病快速诊断和疫病普查。 展开更多

关键词 水貂阿留申病毒 VP2基因 原核表达 DOT-ELISA检测

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牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因在卡介苗中的优化表达 被引量：3

3

作者 曾范利 张云 +5 位作者 张梦 时坤 李建明 刘菲 李晶 杜锐 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期94-100,共7页

为构建牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)基因工程活载体疫苗,根据已知的BVDV Changehun184毒株E2基因序列,利用DN.AStar生物学软件对其进行分析,预测了可能存在的抗原表位,设计6对引物,分别扩增了包含预测抗原位点的6个片段,1—297 aa、1... 为构建牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)基因工程活载体疫苗,根据已知的BVDV Changehun184毒株E2基因序列,利用DN.AStar生物学软件对其进行分析,预测了可能存在的抗原表位,设计6对引物,分别扩增了包含预测抗原位点的6个片段,1—297 aa、1—345 aa、1—374 aa、45—297 aa、45—345 aa和45—374 aa,克隆至穿梭表达载体pMV361中,经酶切、PCR扩增和测序证实已正确插入到表达载体中,构建了6个原核表达质粒。阳性重组质粒通过电转化到卡介苗(BCG)感受态中,热诱导后,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹检测。结果表明6个重组质粒在卡介苗中均有不同程度的表达,表达产物与理论推测的相对分子质量一致。Western blot结果显示其融合蛋白能被牛抗BVDV的阳性血清识别,具有相应的反应原性。本研究为进一步研究BVDV基因工程活载体疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 E₂基因 卡介苗 优化表达

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一例冰下低温爆发的锦鲤疱疹病毒病的鉴定 被引量：9

4

作者 邢程 王好 +1 位作者 周井祥 王友超 《水产学杂志》 CAS 2014年第1期46-49,共4页

2013年4月初低温下，吉林省白山地区某网箱养殖场鲤（Cyprinus carpioL．）大量死亡，病死鲤无明显临床病变。采用PCR扩增技术检测了这些病鱼，结果表明，该低温爆发的疾病为锦鲤疱疹病毒病（KHVD）。这种病常爆发在水温为18-28℃的春... 2013年4月初低温下，吉林省白山地区某网箱养殖场鲤（Cyprinus carpioL．）大量死亡，病死鲤无明显临床病变。采用PCR扩增技术检测了这些病鱼，结果表明，该低温爆发的疾病为锦鲤疱疹病毒病（KHVD）。这种病常爆发在水温为18-28℃的春秋季，冰下爆发还未有报道。本次锦鲤疱疹病毒病的鉴定，对于锦鲤疱疹病毒感染鲤温度条件的变化和疾病的预防提供了参考。 展开更多

关键词 锦鲤疱疹病毒 低温爆发 PCR技术

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不同毒力结核分枝杆菌对THP-1细胞凋亡及细胞因子表达的影响 被引量：2

5

作者 张妍 宋纪伟 +6 位作者 曾范利 时坤 李健明 刘杨 刘菲 孙凡婷 杜锐 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1600-1605,共6页

为探讨不同毒力结核分枝杆菌(MTB)感染巨噬细胞后不同时间点细胞凋亡情况与其分泌的几种主要细胞因子转录与表达之间的关系,建立THP-1体外巨噬细胞模型,用不同毒力MTB(强毒株H37Rv、弱毒株BCG)感染细胞,应用流式细胞术检测巨噬细胞在六... 为探讨不同毒力结核分枝杆菌(MTB)感染巨噬细胞后不同时间点细胞凋亡情况与其分泌的几种主要细胞因子转录与表达之间的关系,建立THP-1体外巨噬细胞模型,用不同毒力MTB(强毒株H37Rv、弱毒株BCG)感染细胞,应用流式细胞术检测巨噬细胞在六个时间点的凋亡情况,应用荧光定量PCR检测细胞因子TNF-α、IL-10、IL-6的转录水平,应用ELISA方法检测细胞上清液中三种细胞因子的分泌量。结果显示:BCG组和H37Rv组的早期凋亡率均显著高于对照组(P<0.05)。巨噬细胞细胞因子TNF-α、IL-6的转录水平与分泌水平相符,弱毒菌株巨噬细胞凋亡情况随时间延长成上升趋势,其分泌的细胞因子TNF-α表现为相同趋势,IL-6表现为相反趋势。强毒株巨噬细胞凋亡情况低于弱毒株,细胞因子分泌情况复杂,一般表现为一种先增强后抑制的情况。本试验通过对不同时间点细胞因子与凋亡情况关系的研究为结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡机制提供新思路。 展开更多

关键词 不同毒力结核分枝杆菌 THP-1细胞 凋亡 细胞因子

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牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因重组卡介苗初步免疫研究 被引量：2

6

作者 李健明 杨宇航 +5 位作者 王慧慧 曾范利 时坤 张妍 刘菲 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期146-149,共4页

为评价表达牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2基因重组卡介苗(rBCG)的初步免疫效果,本研究分别将rBCG-pMV261-E2和rBCG-pMV361-E2免疫实验用大耳白兔,通过间接ELISA方法和T淋巴细胞转化试验分别检测兔体内体液免疫和细胞免疫应答水平。... 为评价表达牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2基因重组卡介苗(rBCG)的初步免疫效果,本研究分别将rBCG-pMV261-E2和rBCG-pMV361-E2免疫实验用大耳白兔,通过间接ELISA方法和T淋巴细胞转化试验分别检测兔体内体液免疫和细胞免疫应答水平。结果显示在体液免疫方面,两组rBCG均从第7 d开始产生BVDV抗体,抗体水平逐渐上升,在42 d达到峰值,并且rBCG-pMV361-E2刺激所产生的抗体水平始终高于rBCG-pMV261-E2;而rBCG血清中的抗结核菌抗体水平与正常BCG无显著差异,与BVDV阳性对照组和阴性对照组之间则差异显著;在细胞免疫方面,与阴性对照组相比,两组rBCG与BVDV灭活苗相同,免疫实验兔后淋巴细胞对特异性刺激均有明显的增殖。表明两组rBCG免疫实验兔后均使其产生了体液免疫应答和细胞免疫应答,为进一步研制BVDV新型基因工程疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 E2基因 重组卡介苗

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不同毒力结核分支杆菌感染RAW264.7巨噬细胞不同时间细胞因子转录水平标准曲线的建立及应用 被引量：1

7

作者 张妍 宋纪伟 +6 位作者 曾范利 时坤 李健明 刘杨 刘菲 孙凡婷 杜锐 《中国兽药杂志》 2014年第12期5-10,共6页

为检测不同毒力结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细胞因子转录水平的变化,构建IL-6、IL-10、TNF-α重组标准质粒,建立了实时荧光定量PCR标准曲线。应用该方法对不同毒力结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞6个时间点细胞因子的转录水平进行分析... 为检测不同毒力结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细胞因子转录水平的变化,构建IL-6、IL-10、TNF-α重组标准质粒,建立了实时荧光定量PCR标准曲线。应用该方法对不同毒力结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞6个时间点细胞因子的转录水平进行分析,结果显示H37Rv组、BCG组相比于对照组刺激后均使三种细胞因子的转录水平发生变化,其中IL-6和TNF-α发生明显变化。本试验通过对不同时间点细胞因子转录水平的分析为结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡机制的研究提供新思路。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 RAW264.7细胞 荧光定量PCR 细胞因子

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副结核分枝杆菌SOD基因在BHK-21细胞中的表达 被引量：1

8

作者 胡玉庆 曾范利 +2 位作者 刘新宇 宁浩然 姜秀云 《中国兽药杂志》 2010年第7期6-8,46,共4页

将重组质粒pGEM-T-SOD中的副结核分枝杆菌SOD基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建真核表达重组质粒pVAX1-SOD,以脂质体介导法转染至BHK-21细胞中,并采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测SOD基因在BHK-21细胞中的表达。结果显示,成功地构... 将重组质粒pGEM-T-SOD中的副结核分枝杆菌SOD基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建真核表达重组质粒pVAX1-SOD,以脂质体介导法转染至BHK-21细胞中,并采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测SOD基因在BHK-21细胞中的表达。结果显示,成功地构建了副结核分枝杆菌SOD基因的真核表达载体,且SOD基因在哺乳动物细胞中获得了表达。为研究副结核分枝杆菌SOD基因的免疫效果及作为牛副结核病DNA疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 副结核分枝杆菌 SOD基因 真核表达

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19ku脂蛋白信号肽优化表达的牛病毒性腹泻病毒E2基因重组卡介苗初步免疫研究

9

作者 时坤 孙凡婷 +4 位作者 张妍 李晶 刘菲 刘杨 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期962-965,共4页

为评价19ku脂蛋白信号肽优化表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组卡介苗对小鼠的免疫效果,本研究将已构建的rBCG/19ku-E_2、rBCG/E_2、rBCG/pMV261(pMV261空载体构建的rBCG作为实验对照组)、卡介苗(BCG)及BVDV灭活苗免疫小鼠,通过检测血... 为评价19ku脂蛋白信号肽优化表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组卡介苗对小鼠的免疫效果,本研究将已构建的rBCG/19ku-E_2、rBCG/E_2、rBCG/pMV261(pMV261空载体构建的rBCG作为实验对照组)、卡介苗(BCG)及BVDV灭活苗免疫小鼠,通过检测血清抗体效价、T淋巴细胞亚群含量及细胞因子水平,评价其体液免疫与细胞免疫效果。结果显示,rBCG/19ku-E_2可以引起BVDV特异性抗体的产生,并且抗体水平要高于rBCG/E_2、rBCG/pMV261组。对CD4^+、CD8^+T淋巴细胞亚群含量的检测结果表明,rBCG免疫小鼠对CD4^+、CD8^+T淋巴细胞亚群没有显著影响。通过对IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ细胞因子检测结果表明,rBCG主要诱导Th1型细胞免疫应答,rBCG/19ku-E_2诱导的细胞因子水平低于BCG免疫组,但均高于细胞因子的平均水平。结果表明,rBCG/19ku-E_2可以诱导小鼠产生较好的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,为BVDV新型疫苗研究奠定基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 19 ku脂蛋白信号肽 重组卡介苗 免疫

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结核分支杆菌Rv3117基因的克隆与原核表达

10

作者 刘杨 宋纪伟 +3 位作者 曾范利 时坤 李健明 杜锐 《动物医学进展》 北大核心 2015年第5期15-18,共4页

以结核分支杆菌H37Rv株染色体DNA为模板,应用Rv3117基因特异性引物对该基因进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。将PCR纯化产物克隆至pMD-18T Vector中,构建出重组质粒pMD-18T-Rv3117。以EcoRⅠ和SamⅠ双酶切pMD-18T-Rv3117重组载体和pGE... 以结核分支杆菌H37Rv株染色体DNA为模板,应用Rv3117基因特异性引物对该基因进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。将PCR纯化产物克隆至pMD-18T Vector中,构建出重组质粒pMD-18T-Rv3117。以EcoRⅠ和SamⅠ双酶切pMD-18T-Rv3117重组载体和pGEX-4T-1原核表达载体,并将纯化的Rv3117基因亚克隆至pGEX-4T-1中,构建出原核重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3117。将pGEX-4T-1-Rv3117重组质粒转化至感受态E.coli BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约30ku目的蛋白带。Western blot分析结果显示,该蛋白能与抗结核分支杆菌阳性血清发生特异性反应。研究结果为结核病临床诊断抗原的筛选奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分支杆菌 Rv3117基因 克隆 原核表达

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水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达

11

作者 李晶 时坤 +2 位作者 曾范利 宋继伟 杜锐 《动物医学进展》 北大核心 2015年第4期15-18,共4页

为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进... 为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进行诱导表达,确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和Western blot分析,表明终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h目的蛋白的表达量最高,分子质量约为53ku。SDS-PAGE分析表明,葡萄糖和乙醇抑制了目的蛋白的表达,而蔗糖、甘油和二甲基亚砜提高了目的蛋白的表达量,获得的目的蛋白具有良好的反应原性。 展开更多

关键词 水貂阿留申病病毒 VP2截短基因 原核表达

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牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E_2基因重组卡介苗的构建

12

作者 时坤 王文玉 +3 位作者 王慧慧 曾范利 李健明 杜锐 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2014年第7期32-35,共4页

本试验将成功克隆的牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因与大肠杆菌-分枝杆菌整合表达载体pMV361连接,构建重组整合质粒pMV361-E2。并确定了电转化的最佳条件:2.0 kV/cm、25μF、1 000Ω,成功获得了E2基因重组卡介苗。在45℃... 本试验将成功克隆的牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因与大肠杆菌-分枝杆菌整合表达载体pMV361连接,构建重组整合质粒pMV361-E2。并确定了电转化的最佳条件:2.0 kV/cm、25μF、1 000Ω,成功获得了E2基因重组卡介苗。在45℃下热诱导E2基因在重组卡介苗中的表达,通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测,结果显示,在44 kD处出现目的条带,符合E2基因表达蛋白的大小,表明牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因在卡介苗中成功表达。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 E2基因 重组卡介苗 构建

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鹿尾蛋白与多肽制备工艺优化及其对TM3细胞增殖活性研究 被引量：5

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作者 郭鑫 吴梦阳 +4 位作者 郭子奕 时坤 李建明 宗颖 杜锐 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2019年第22期181-186,共6页

以梅花鹿尾为研究对象,采用正交试验优化超声水提蛋白工艺及水酶法提取多肽工艺,比较两种最佳工艺所得物对小鼠睾丸间质细胞(TM3)增殖活性的影响。结果表明,超声水提蛋白工艺最佳条件为料液比1∶5 g/mL、超声功率200 W、提取时间1 h、... 以梅花鹿尾为研究对象,采用正交试验优化超声水提蛋白工艺及水酶法提取多肽工艺,比较两种最佳工艺所得物对小鼠睾丸间质细胞(TM3)增殖活性的影响。结果表明,超声水提蛋白工艺最佳条件为料液比1∶5 g/mL、超声功率200 W、提取时间1 h、提取温度40℃,在此条件下蛋白含量为60.72%±0.56%;水酶法提取多肽工艺中最佳蛋白酶为胰蛋白酶,酶解最佳条件为pH8、加酶量1500 U/g、酶解时间4 h、提取温度50℃,在此条件下水解度为22.85%±0.35%。水酶法提取鹿尾多肽对小鼠睾丸间质细胞(TM3)增殖活性优于超声水提鹿尾蛋白。 展开更多

关键词 鹿尾 蛋白 多肽 酶解产物 CCK-8法 小鼠睾丸间质细胞(TM3) 增殖活性

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植物精油的抑菌作用研究进展 被引量：8

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作者 王慧 周红潮 +5 位作者 张旭 任晓航 时坤 李建明 杜锐 宗颖 《动物医学进展》 北大核心 2019年第4期107-111,共5页

近年来,随着细菌/真菌感染率大幅度上升,食源性疾病的全球发病率不断增多,而伴随致病菌耐药性的出现,现有抗菌药物的抑菌效果越来越有限,并对机体产生较大的毒副作用。精油系植物提取物的主要有效组分具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤... 近年来,随着细菌/真菌感染率大幅度上升,食源性疾病的全球发病率不断增多,而伴随致病菌耐药性的出现,现有抗菌药物的抑菌效果越来越有限,并对机体产生较大的毒副作用。精油系植物提取物的主要有效组分具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤和抗菌等多重药理作用,其显著的抗细菌和抗真菌活性对于解决食品中日渐增多的耐药性细菌/真菌感染问题有着重要意义。论文对植物精油抑菌作用进行阐述,并详细地分析精油主要成分含量的影响因素,为更好的利用精油提供参考,同时为保障食品安全及相关研究提供科学依据。 展开更多

关键词 植物精油 抑菌作用 食源性疾病

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水貂阿留申病毒诱导CrFK细胞凋亡信号通路的研究 被引量：3

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作者 葛桂阳 栾美慧 +8 位作者 宫庆龙 刘艺 李东丽 麻宝艺 盛陈艳 时坤 李健明 冷雪 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1089-1095,共7页

本实验室前期研究表明水貂阿留申病毒(AMDV)G株感染猫肾细胞(CrFK)可以引起其凋亡,为研究AMDV在体外通过何种途径诱导CrFK细胞的凋亡,本实验采用MOI 1的AMDV G株感染CrFK细胞,于感染后不同时间(2 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h,下同... 本实验室前期研究表明水貂阿留申病毒(AMDV)G株感染猫肾细胞(CrFK)可以引起其凋亡,为研究AMDV在体外通过何种途径诱导CrFK细胞的凋亡,本实验采用MOI 1的AMDV G株感染CrFK细胞,于感染后不同时间(2 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h,下同)通过分光光度法检测试剂盒检测Caspase-8、Caspase-9的活性;利用western blot检测Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达情况。采用Caspase-8和Caspase-9抑制剂处理CrFK细胞后感染AMDV G株,于不同时间检测Caspase-3的活性。于AMDV G株感染CrFK细胞后不同时间,利用荧光定量PCR检测细胞中死亡受体通路分子Caspase-8、Fas、FasL和线粒体通路分子Caspase-9、Bax、Bcl-2、Cyt C以及凋亡执行因子Caspase-3的mRNA转录水平;采用JC-10线粒体膜电位试剂盒检测各时间点细胞线粒体膜电位的去极化情况。结果显示,AMDV G株感染CrFK细胞后不同时间Caspase-8的活性均无明显变化,而Caspase-9的活性则随感染时间的延长而明显增强;western blot结果显示,Caspase-8蛋白的表达不受影响,而Caspase-9在AMDV感染后12 h被切割活化。Caspase-3活性的检测结果显示,抑制CrFK细胞中Caspase-8的活性后再感染AMDV,Caspase-3的活性逐渐增强,而抑制细胞中Caspase-9的活性后再感染AMDV,则Caspase-3的活性无明显变化,即抑制了Caspase-9再感染AMDV并不能诱导细胞凋亡;荧光定量PCR结果显示,AMDV感染CrFK细胞后不同时间Caspase-8、Fas、FasL基因的转录水平均无明显变化,而Caspase-9、Caspase-3、Cyt C基因mRNA转录水平及Bax/Bcl-2的比值则随感染时间的延长而逐渐升高。线粒体膜电位结果显示,AMDV感染的CrFK细胞线粒体膜电位下降,发生了明显去极化现象,表现为细胞发生了凋亡。综上,本研究首次证实AMDV G株感染CrFK细胞后激活了线粒体途径的细胞凋亡执行分子Caspase-3及线粒体通路相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-9和Cyt C,并未激活死亡受体通路相关分子,AMDV G株是通过激活细胞线粒体通路而诱导CrFK细胞的凋亡。本研究为AMDV感染CrFK细胞凋亡机制的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 水貂阿留申病毒 CrFK细胞 凋亡 信号通路

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中药抗牛病毒性腹泻病毒作用研究现状 被引量：3

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作者 王慧 杜锐 +4 位作者 周红潮 时坤 李建明 曾范利 宗颖 《动物医学进展》 北大核心 2018年第2期123-126,共4页

将牛病毒性腹泻病毒侵染细胞过程与中药抗病毒的作用机理相结合,对中药体外抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作用的现代研究内容及方法进行总结,同时针对已研究出的具有抗牛病毒性腹泻病毒活性作用的中药有效部位及中药复方的研究现状进行了全... 将牛病毒性腹泻病毒侵染细胞过程与中药抗病毒的作用机理相结合,对中药体外抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作用的现代研究内容及方法进行总结,同时针对已研究出的具有抗牛病毒性腹泻病毒活性作用的中药有效部位及中药复方的研究现状进行了全面的阐述,为开展抗BVDV中药的筛选及深入研究提供借鉴,为牛病毒性腹泻病毒引起的传染性疾病的研究与防控提供新的思路,为抗牛病毒性腹泻病毒的中药制剂开发提供科学依据,并展望了抗BVDV的中药开发前景以供参考。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 中药 有效部位 中药复方

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牛分枝杆菌mpb51-63融合基因的克隆及其原核表达 被引量：2

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作者 李璐璐 王春芳 +6 位作者 任飞 刘新宇 宁浩然 刘磊 李冰洁 姜秀云 何昭阳 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期898-900,共3页

为提高牛分枝杆菌(M.bovis)单一抗原的抗原性,本研究以重叠延伸拼接PCR技术将M.bovis mpb51与mpb63基因连接,并克隆至pMD18-T中,构建重组质粒pMD-51-63。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD-51-63和pET28a(+),将纯化的mpb51-63融合基因亚克隆至p... 为提高牛分枝杆菌(M.bovis)单一抗原的抗原性,本研究以重叠延伸拼接PCR技术将M.bovis mpb51与mpb63基因连接,并克隆至pMD18-T中,构建重组质粒pMD-51-63。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD-51-63和pET28a(+),将纯化的mpb51-63融合基因亚克隆至pET28a(+)中,获得了重组表达质粒pET-51-63。该重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达约46 ku的外源融合蛋白,免疫印迹实验证实,该融合蛋白具有M.bovis的抗原反应性。为进一步研究mpb51-63融合基因及其表达产物作为牛结核病亚单位疫苗、核酸疫苗以及特异的诊断试剂奠定了基础。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 mpb51-63融合基因 克隆 原核表达

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水貂阿留申病毒感染过程中主要分子蛋白作用机理研究进展 被引量：1

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作者 栾美慧 李健明 +7 位作者 时坤 刘艺 徐宁 郜艳雪 宫庆龙 孙志博 冷雪 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期973-976,共4页

水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由AMD病毒(AMDV)感染水貂引起的自身免疫系统功能紊乱,并引发自身免疫的慢性、传染性疾病,在全球范围的水貂养殖国家造成了重大的经济损失[1-2]。由于其特殊的致病机制和抗体依赖性增强作用(A... 水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由AMD病毒(AMDV)感染水貂引起的自身免疫系统功能紊乱,并引发自身免疫的慢性、传染性疾病,在全球范围的水貂养殖国家造成了重大的经济损失[1-2]。由于其特殊的致病机制和抗体依赖性增强作用(ADE)[3-4],尚无预防该病的商业疫苗。目前主要通过检疫淘汰病貂来净化貂厂,但该方法无法从根本上杜绝该病的发生发展。因此国内外对AMDV致病机制进行了大量研究,结果表明AMDV中参与ADE的结构蛋白、负责调控病毒复制的非结构蛋白及宿主的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)在致病机制中具有重要作用。本文对AMDV感染过程中各主要分子蛋白的相关调控进行阐述,以期为AMDV的致病机理以及进一步研究和防治AMD奠定理论基础。 展开更多

关键词 水貂阿留申病毒 感染过程 非结构蛋白 致病机制 自身免疫 传染性疾病 病毒复制 水貂养殖

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抑制鹿源多药耐药结核菌中药的筛选 被引量：2

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作者 姜园园 李温明 +7 位作者 刘畅 曾范利 时坤 李健明 刁乃超 李仲乐 刘东旭 杜锐 《动物医学进展》 北大核心 2016年第4期54-57,共4页

为了筛选对鹿源多药耐药结核菌有效的中药耐药抑制剂,通过MABA法检测24种中药的水和乙醇提取物对多药耐药结核菌及标准菌H37Rv的体外抗菌效果,将筛选出的抗菌效果好的黄连醇提物和黄连水提物采用紫外分光光度法进行活性成分含量测定,同... 为了筛选对鹿源多药耐药结核菌有效的中药耐药抑制剂,通过MABA法检测24种中药的水和乙醇提取物对多药耐药结核菌及标准菌H37Rv的体外抗菌效果,将筛选出的抗菌效果好的黄连醇提物和黄连水提物采用紫外分光光度法进行活性成分含量测定,同时以MABA法与标准品比较体外抗结核菌活性。结果显示,黄连、独活和侧柏叶有明显的抗结核活性,其中黄连水粗提物和乙醇粗提物效果最佳,测得它们活性成分即总生物碱含量分别为22.74%和35.23%,并显示二者与小檗碱的体外抗结核作用相同。 展开更多

关键词 鹿 多药耐药结核菌 中药 耐药抑制剂

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结核分枝杆菌Rv1048c基因异源表达菌株的构建及其对小鼠巨噬细胞存活率的影响研究 被引量：1

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作者 徐金彪 秦守涛 +3 位作者 丛薇 时坤 李健明 曾范利 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期228-234,共7页

目的对结核分枝杆菌H37Rv菌株中功能未知基因Rv1048c进行生物信息学分析,构建重组表达菌株MS_Rv1048c,并研究其对小鼠巨噬细胞存活率的影响。方法软件在线分析Rv1048c的氨基酸序列及其编码蛋白的基本性质,利用PCR扩增Rv1048c目的片段,... 目的对结核分枝杆菌H37Rv菌株中功能未知基因Rv1048c进行生物信息学分析,构建重组表达菌株MS_Rv1048c,并研究其对小鼠巨噬细胞存活率的影响。方法软件在线分析Rv1048c的氨基酸序列及其编码蛋白的基本性质,利用PCR扩增Rv1048c目的片段,构建重组质粒pMV261-Rv1048c,转入耻垢分枝杆菌,构建重组菌株MS_Rv1048c与空载菌MS_vec。分析该基因对菌株生长的影响;通过CCK-8、总胆固醇测定和油红(O)染色的方法,初步探究重组菌株感染巨噬细胞后对其活性的影响。结果Rv1048c基因全长1116 bp,蛋白由371个氨基酸构成,分子式是C_(1778)H_(2821)N_(521)O_(525)S_(10),预测该蛋白是一种定位在细胞外的含有多个磷酸化位点的、不稳定的亲水性蛋白。本试验首次成功构建未知基因Rv1048c的异源表达载体,生长曲线测定发现该基因使菌株生长缓慢,细胞实验发现基因增强了重组菌株对细胞的侵袭能力。结论Rv1048c可能具有结核分枝杆菌独有的生长特性,并降低在菌株侵染下的细胞的存活率。分析Rv1048c未知基因和构建异源表达菌株,有助于后续对结核分枝杆菌Rv1048c基因功能的探究,为进一步解析结核分枝杆菌的致病机制奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 生物信息学分析 pMV261 Rv1048c基因 巨噬细胞RAW 264.7

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