为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和p...为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和pMD19-T-gE为模板,采用方阵法优化各反应条件,初步建立了检测IBRV的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法,并建立荧光定量PCR标准曲线。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛肠道病毒(BEV)和牛流行热病毒(BEFV)等RNA反转录所得cDNA及IBRV基因组DNA为模板,采用本研究建立的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法检测,评估所建方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(108~101)的pMD19-T-gB和pMD19-T-gE质粒标准品作为模板,利用本研究建立的两种方法与普通PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以3个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-gB作为模板,利用TB Green I qPCR方法分别于同一时间和不同时间进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。标准曲线结果显示,质粒标准品pMD19-T-gB在5.54×10^(8)拷贝/μL~5.54×10^(1)拷贝/μL范围内与其Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2=0.999,溶解曲线为单一峰。特异性试验结果显示,所建立的两种方法仅能检出IBRV,其他病毒均为阴性结果,特异性强。敏感性试验结果显示,所建立的TB Green I qPCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gB的检测限为55.4拷贝/μL;Nano PCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gE的检测限为4.28×10^(3)拷贝/μL,所建立两种方法的敏感性均较高。重复性试验结果显示,该qPCR方法批内、批间重复性试验的变异系数在0.16%~0.67%,重复性较好。采用本实验建立的两种方法和普通PCR方法对延边地区采集的50份疑似IBRV感染的样品进行检测,结果显示,普通PCR对样品的阳性检测率为84%(42/50),Nano PCR对样品的阳性检测率为90%(45/50),qPCR对样品的阳性检测率为92%(46/50),3种检测方法的总符合率均高于85%。本研究建立的qPCR方法对样品的阳性检出率最高、特异性更强,为临床样品的快速检测及相应疾病早期诊断的首选;Nano PCR次之。本实验首次同时建立并比较了用于IBRV检测的TB Green I qPCR方法与Nano PCR方法,且首次对延边地区的IBRV流行病学作了初步调查,为牛养殖业和疫病防控工作提供技术支撑和参考依据。展开更多
本研究构建了一种牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)的高效临床检测方法。利用SYBR Green I荧光定量PCR扩增BVDV-1保守基因5'UTR的片段(124 bp),并构建重组质粒作为阳性标准品,建立标准曲线,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,...本研究构建了一种牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)的高效临床检测方法。利用SYBR Green I荧光定量PCR扩增BVDV-1保守基因5'UTR的片段(124 bp),并构建重组质粒作为阳性标准品,建立标准曲线,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,同时采集临床样品,评价其检测效率。结果显示:BVDV-1阳性标准品在1.169×10^(8)~1.169×10^(1)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数R^(2)=0.997,熔解曲线无非特异性峰产生;重复性试验组内和组间变异系数低于2%;敏感性试验最低检测拷贝数为1.169×10^(1)拷贝/μL,为普通PCR的100倍;特异性良好,与BEV、BEFV、IBRV、BPIV3无交叉反应产生。采用建立的BVDV-1 SYBR GreenⅠ荧光定量方法检测62份牛腹泻粪便样品,阳性率为46.77%,高于普通PCR^(2)0.97%。本研究成功建立了BVDV-1荧光定量方法,该方法特异性强,灵敏度高,重复性稳定,可用于养殖业BVDV-1临床的快速检测。展开更多
文摘为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和pMD19-T-gE为模板,采用方阵法优化各反应条件,初步建立了检测IBRV的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法,并建立荧光定量PCR标准曲线。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛肠道病毒(BEV)和牛流行热病毒(BEFV)等RNA反转录所得cDNA及IBRV基因组DNA为模板,采用本研究建立的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法检测,评估所建方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(108~101)的pMD19-T-gB和pMD19-T-gE质粒标准品作为模板,利用本研究建立的两种方法与普通PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以3个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-gB作为模板,利用TB Green I qPCR方法分别于同一时间和不同时间进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。标准曲线结果显示,质粒标准品pMD19-T-gB在5.54×10^(8)拷贝/μL~5.54×10^(1)拷贝/μL范围内与其Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2=0.999,溶解曲线为单一峰。特异性试验结果显示,所建立的两种方法仅能检出IBRV,其他病毒均为阴性结果,特异性强。敏感性试验结果显示,所建立的TB Green I qPCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gB的检测限为55.4拷贝/μL;Nano PCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gE的检测限为4.28×10^(3)拷贝/μL,所建立两种方法的敏感性均较高。重复性试验结果显示,该qPCR方法批内、批间重复性试验的变异系数在0.16%~0.67%,重复性较好。采用本实验建立的两种方法和普通PCR方法对延边地区采集的50份疑似IBRV感染的样品进行检测,结果显示,普通PCR对样品的阳性检测率为84%(42/50),Nano PCR对样品的阳性检测率为90%(45/50),qPCR对样品的阳性检测率为92%(46/50),3种检测方法的总符合率均高于85%。本研究建立的qPCR方法对样品的阳性检出率最高、特异性更强,为临床样品的快速检测及相应疾病早期诊断的首选;Nano PCR次之。本实验首次同时建立并比较了用于IBRV检测的TB Green I qPCR方法与Nano PCR方法,且首次对延边地区的IBRV流行病学作了初步调查,为牛养殖业和疫病防控工作提供技术支撑和参考依据。
