NUF2对泛癌的预后和免疫治疗效果的预测价值

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作者 王耀彬 陈柳燕 +2 位作者 罗伊凌 申继清 周素芳 《南方医科大学学报》 北大核心 2025年第1期137-149,共13页

目的探讨NUF2表达水平与肿瘤预后的关系及在肿瘤微环境中的作用。方法综合利用人类蛋白质图谱(HPA)、癌症基因组图谱(TCGA)、基因型-组织表达计划(GTEx)、癌细胞系百科全书(CCLE)、TIMER的数据集,采用生物信息学方法挖掘NUF2的潜在致癌... 目的探讨NUF2表达水平与肿瘤预后的关系及在肿瘤微环境中的作用。方法综合利用人类蛋白质图谱(HPA)、癌症基因组图谱(TCGA)、基因型-组织表达计划(GTEx)、癌细胞系百科全书(CCLE)、TIMER的数据集,采用生物信息学方法挖掘NUF2的潜在致癌作用,包括剖析NUF2在各种类型肿瘤组织中的表达水平、预后价值及免疫价值;采用RT-qPCR、Western blotting、免疫组化(IHC)等实验检测NUF2在肝癌细胞系和肝癌患者癌组织及血液中的表达情况。利用基因本体论(GO)、基因组百科全书(KEGG)和基因集富集分析(GSEA)探索NUF2及相关基因的分子机制并在肝癌中构建了NUF2的竞争性内源RNA(ceRNA)网络。结果与正常组织相比,NUF2表达在27种肿瘤中上调并与多种类型肿瘤的临床分期相关(P<0.05)。在部分肿瘤中,NUF2的表达上调与肿瘤患者的不良预后(总体生存期、疾病特异性生存期、无病生存期和无进展生存期)相关(P<0.05)。NUF2表达水平与多种肿瘤的肿瘤突变负荷、微卫星不稳定、浸润免疫细胞(B细胞、髓样树突状细胞、中性粒细胞、CD4+T细胞)、免疫细胞maker基因(CCR7、CD163、CD19、CD4、CD79A、CD8A、CD8B、IRF5、ITGAX和MS4A4A)以及免疫检查点基因(CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1和PDCD1LG2)呈正相关(P<0.05)。RT-qPCR等实验结果显示NUF2在肝癌细胞系、肝癌患者癌组织和血液中表达上调(P<0.05),其中肝癌患者经手术治疗之后,使得血液中NUF2表达下调(P<0.05)。GO和KEGG富集分析表明,NUF2相关基因与染色体分离、微管运动以及细胞周期相关(P<0.05)。GSEA分析提示,在肝癌中NUF2高表达与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及调控神经活性配体受体相互作用有关(P<0.05)。结论NUF2在27种肿瘤中表达上调并与部分肿瘤的临床分期、不良预后有关。此外NUF2的表达与多种肿瘤的免疫细胞浸润密切相关,可能作为这些癌症免疫治疗效果的潜在预测因子。 展开更多

关键词 NUF2 泛癌分析 免疫浸润 预后

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CDK1、CCNB1和NDC80与乙型肝炎相关肝细胞癌的预后和进展相关:基于生物信息学方法 被引量：5

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作者 李玉杰 吴登强 +2 位作者 韦常宏 杨雪佳 周素芳 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1509-1518,共10页

目的探讨HBV转化为HCC相关的关键基因,并探索相关的分子机制。方法分析基因表达综合(GEO)数据库中GSE55092、GSE84044和GSE121248的mRNA微阵列数据,其中包括119个HBV相关的HCC组织和252个HBV相关的非肿瘤组织。“sva”R包用于去除批间... 目的探讨HBV转化为HCC相关的关键基因,并探索相关的分子机制。方法分析基因表达综合(GEO)数据库中GSE55092、GSE84044和GSE121248的mRNA微阵列数据,其中包括119个HBV相关的HCC组织和252个HBV相关的非肿瘤组织。“sva”R包用于去除批间差。进行整合分析,获取HBV相关肝癌和HBV组织中的差异表达基因(DEGs),通过基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析对差异表达基因进行功能注释。使用相互作用基因搜索工具(STRING)构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,挖掘最重要的模块和关键基因。cBioportal用于分析hub基因的相关性。利用Kaplan-Meier和Oncomine数据库对TCGA数据库中肝癌基因表达数据进行验证,探讨hub基因与肝癌发生、发展和预后的关系。通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)实验验证17对临床肝细胞癌样本与邻近非肿瘤组织中hub基因的表达。结果共获得121个DEGs(P<0.01),鉴定出3个遗传标记,细胞周期素依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白B1(CCNB1)和核分裂周期蛋白80(NDC80),与细胞周期、嘧啶代谢和DNA复制有关,这3个基因高度相关(P<0.05)。UALCAN数据库证实这些基因在肝癌组织中高表达并获得相关预后信息。Kaplan-Meier表明,它们与HCC患者的低存活率相关。CDK1、CCNB1和NDC80与肝癌分级相关(P<0.05),RT-qPCR实验证实CDK1、CCNB1和NDC80的mRNA在肝细胞癌中的表达明显高于癌旁组织。结论CDK1、CCNB1和NDC80基因可作为HBV相关肝细胞癌的预后标志物,在肝癌的基础研究和临床治疗方面有一定的应用价值。 展开更多

关键词 肝细胞癌 慢性乙型肝炎病毒 关键基因 CDK1 CCNB1 NDC80

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黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)的生物信息学分析及真核表达载体的构建 被引量：1

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作者 李霞琼 邓芸婷 +5 位作者 顾永耀 高精洧 罗育 林文珍 谢小薰 贺菽嘉 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期884-889,共6页

目的分析黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)蛋白的理化性质、结构和功能,构建MAGE-D4真核表达载体。方法通过生物信息学软件分析MAGE-D4蛋白的理化性质、结构和功能。以MAGE-D4/pMAL-C2原核重组质粒为模板,经PCR扩增、酶切后与pEGFP-C1真核表... 目的分析黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)蛋白的理化性质、结构和功能,构建MAGE-D4真核表达载体。方法通过生物信息学软件分析MAGE-D4蛋白的理化性质、结构和功能。以MAGE-D4/pMAL-C2原核重组质粒为模板,经PCR扩增、酶切后与pEGFP-C1真核表达质粒连接,转化大肠杆菌。连接产物经抗生素筛选、酶切、测序鉴定后,通过脂质体转染A549肺癌细胞。结果MAGE-D4蛋白为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽,二级结构以α螺旋为主,具有多个功能性修饰位点,主要定位在细胞核。SLLLVILGV可能为MAGE-D4来源的HLA-A*0201限制性T细胞表位。与MAGE-D4存在潜在相互作用的前3位蛋白依次是染色体成分4非结构维持蛋白同源物A(NSMCE4A)、T细胞识别的黑素瘤抗原1(MLANA/MART-1)、黑素瘤B抗原5(BAGE5)。测序结果证实重组质粒含有MAGE-D4的全长编码序列(CDS),能成功转染A549肺癌细胞。结论MAGE-D4蛋白为不稳定核蛋白,可通过与多种黑素瘤相关蛋白相互作用而发挥功能,其来源的短肽可能具有较强的免疫原性,并构建了MAGE-D4真核表达载体。 展开更多

关键词 黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4) 生物信息学分析 PEGFP-C1

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氨基酸代谢重编程对肝细胞癌发生发展及治疗的影响

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作者 张青 周青鸟 林文珍 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1392-1399,共8页

在肿瘤细胞中,特定氨基酸的改变会对癌细胞的代谢产生显著影响,并使肿瘤微环境中的免疫细胞发生改变,影响肿瘤的发生发展和治疗效果。本文首先介绍肿瘤中氨基酸的作用,从外源性氨基酸的摄入,氨基酸修饰,支链氨基酸的代谢探讨肿瘤中必需... 在肿瘤细胞中,特定氨基酸的改变会对癌细胞的代谢产生显著影响,并使肿瘤微环境中的免疫细胞发生改变,影响肿瘤的发生发展和治疗效果。本文首先介绍肿瘤中氨基酸的作用,从外源性氨基酸的摄入,氨基酸修饰,支链氨基酸的代谢探讨肿瘤中必需氨基酸的代谢,并阐明非必需氨基酸在非必需氨基酸营养缺陷型肿瘤中的作用。其次,阐述了氨基酸代谢重编程对肝细胞癌发生发展的影响。必需氨基酸和非必需氨基酸在肝细胞癌中存在不可或缺的作用。在肝癌细胞内,必需氨基酸含量异常升高,促进肝癌细胞的发生发展,但支链氨基酸含量的升高却存在双重作用。非必需氨基酸在肝癌细胞中常作为抑制因子发挥作用,但精氨酸可联合天冬酰胺形成正反馈循环促进肝细胞癌的发生发展。最后阐述了氨基酸代谢重编程对肝细胞癌治疗的影响。谷氨酸、丝氨酸,支链氨基酸,S-腺苷甲硫氨酸,甘氨酸,精氨酸等可作为肝细胞癌的作用靶点,抑制氧化戊二酸脱氢酶的表达可以提高肝细胞癌患者对索拉非尼的药物敏感性。肝细胞癌肿瘤微环境中的氨基酸代谢重编程促进了肝癌细胞的恶性增殖和免疫逃逸,研究其中特异性改变的氨基酸有利于为患者制定个性化的免疫治疗。 展开更多

关键词 氨基酸代谢 支链氨基酸 非必需氨基酸 肿瘤 肝细胞癌

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5种马鞭草科药用植物的抗补体活性 被引量：19

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作者 焦杨 邹录惠 +3 位作者 邱莉 谢云峰 罗艳 谢集照 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期469-473,共5页

采用细胞溶血法考察了千解草(Pygmaeopremna herbacea)、白花灯笼(Clerodendrum fortunatum L.)、尖尾枫[Callicarpa longissima(Hemsl.)Merr.]、赪桐[Clerodendrum japonicum(Thunb.)Sweet]及臭茉莉(Clerodendrum philippinum Schauer ... 采用细胞溶血法考察了千解草(Pygmaeopremna herbacea)、白花灯笼(Clerodendrum fortunatum L.)、尖尾枫[Callicarpa longissima(Hemsl.)Merr.]、赪桐[Clerodendrum japonicum(Thunb.)Sweet]及臭茉莉(Clerodendrum philippinum Schauer var.simplex Moldenke)等5种马鞭草科药用植物提取物经典途径和旁路途径的抗补体活性。结果表明:千解草水提取物、白花灯笼水提取物和醇提取物、尖尾枫水提取物和醇提取物、赪桐醇提取物及臭茉莉醇提取物有较强的经典途径抗补体活性,对经典途径的抗补体活性(CH50)分别为0.092±0.008,0.074±0.008,0.088±0.006,0.134±0.017,0.123±0.010,0.380±0.080及0.200±0.015 g/L;仅千解草和尖尾枫水提取物及白花灯笼醇提取物具有旁路途径抗补体活性,对旁路途径的抗补体活性(AP50)分别为0.533±0.033,0.758±0.031和0.362±0.029 g/L。因此,5种植物均具有不同程度的抗补体活性,其中白花灯笼醇提取物抗补体活性最强。 展开更多

关键词 马鞭草科 白花灯笼 赪桐 臭茉莉 尖尾枫 千解草 抗补体活性

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马氏珠母贝肉酶解条件优化及其产物活性分析 被引量：3

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作者 付晶晶 张艳雯 +1 位作者 吴耀生 孙健 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期119-126,共8页

【目的】优化超声波辅助酶解马氏珠母贝肉工艺条件,并对酶解产物进行自由基清除活性分析,为马氏珠母贝肉的高值化利用提供参考依据。【方法】以马氏珠母贝肉为原料,采用单因素及响应面试验分析酶解温度、加酶量、超声功率和酶解时间对... 【目的】优化超声波辅助酶解马氏珠母贝肉工艺条件,并对酶解产物进行自由基清除活性分析,为马氏珠母贝肉的高值化利用提供参考依据。【方法】以马氏珠母贝肉为原料,采用单因素及响应面试验分析酶解温度、加酶量、超声功率和酶解时间对珠母贝肉蛋白质水解度的影响,确定最佳工艺参数,并测定酶解产物对羟基自由基(·OH)、超氧自由基()及DPPH自由基(DPPH·)的清除能力。【结果】影响马氏珠母贝肉酶解效果的4个因素主次顺序为:超声波功率>加酶量>酶解温度>酶解时间,其中酶解温度、加酶量和超声波功率影响极显著(P<0.01),酶解时间及加酶量与超声波功率的交互作用影响显著(P<0.05)。马氏珠母贝肉最佳超声波辅助酶解条件为:酶解温度48℃、加酶量2200 U/g、超声波功率13%(总输出功率900 W)、酶解时间12 min,在此条件下的蛋白质水解度为21.937%,与预测值(22.140%)的相对误差为0.92%。酶解产物对·OH、和DPPH·的清除能力随酶解产物质量浓度的增加而增强,当质量浓度为2.0 mg/m L时,清除率分别为68.85%、83.62%和82.36%。【结论】优化得到的超声波辅助酶解马氏珠母贝肉工艺参数准确可靠,酶解时间显著缩短,酶解产物具有明显的清除自由基活性,可作为具有抗氧化作用的保健食品、保健酒等产品的优质原料。 展开更多

关键词 马氏珠母贝肉 超声波辅助酶解 响应面法 清除自由基活性

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黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体的制备和应用 被引量：5

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作者 贺菽嘉 顾永耀 +5 位作者 肖绍文 张庆梅 陈芳 罗彬 付骏 谢小薰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期104-108,共5页

目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶... 目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶柱亲和层析法纯化后,通过SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA、Western blot法检测抗体的效价及特异性;免疫组织化学染色法检测肺癌组织中MAGE-D4的表达及定位。结果获得纯度较高的抗MAGE-D4多克隆抗体,ELISA检测抗体的效价为1∶256 000,Western blot法分析显示MAGE-D4多克隆抗体可特异性识别MAGE-D4重组蛋白,免疫组织化学结果表明,该抗体能识别肺癌组织中的内源性MAGE-D4蛋白,表达的阳性率为69.6%(17/23)。结论制备的MAGE-D4多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度。 展开更多

关键词 黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4) 多克隆抗体 肿瘤相关抗原

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二维纳米材料抗β-淀粉样蛋白治疗阿尔茨海默病 被引量：3

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作者 卢新良 李金玲 刘斯佳 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期595-602,共8页

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种老年人群中高发的进行性神经退行性疾病。β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)假说是目前科学界广泛支持的AD发病机制。清除Aβ、阻止Aβ聚集和解聚Aβ纤维的策略有望给AD的治疗提供有效途径... 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种老年人群中高发的进行性神经退行性疾病。β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)假说是目前科学界广泛支持的AD发病机制。清除Aβ、阻止Aβ聚集和解聚Aβ纤维的策略有望给AD的治疗提供有效途径。然而,目前已报道的抗Aβ治疗AD的药物存在的诸多缺点,限制了其临床应用。随着纳米技术的飞速发展,二维纳米材料在医学上的应用逐渐受到研究人员的关注。二维纳米材料不仅理化特性优异,而且生物相容性良好,还易于穿越细胞膜及血脑屏障。近年来研究发现,多种二维纳米材料能通过分子间相互作用力、近红外光热效应、光催化氧化、Cu2+螯合以及药物负载等机制来抑制Aβ聚集,或使Aβ纤维解聚,在治疗AD方面有着很大的潜力。本文将围绕石墨烯和类石墨烯二维纳米材料,例如二硫化钼、石墨相氮化碳、黑磷等用于抗Aβ治疗AD方面的研究进行综述。 展开更多

关键词 二维纳米材料 Β-淀粉样蛋白 阿尔茨海默病 抗Aβ治疗

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TLR2和TLR6在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用 被引量：2

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作者 宁雪萍 杨东君 +2 位作者 张依 田爽 凌敏 《广西科学》 CAS 2018年第3期318-324,共7页

【目的】建立鸟分枝杆菌感染巨噬细胞模型,探讨Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体6(TLR6)在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用,为阐明鸟分枝杆菌致病机制提供依据。【方法】用鸟分枝杆菌感染U937细胞,于感染0h、8h、16h、24h和48h后分别... 【目的】建立鸟分枝杆菌感染巨噬细胞模型,探讨Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体6(TLR6)在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用,为阐明鸟分枝杆菌致病机制提供依据。【方法】用鸟分枝杆菌感染U937细胞,于感染0h、8h、16h、24h和48h后分别提取细胞总蛋白,并通过Western blot方法检测TLR2和TLR6的表达;分别提取细胞培养上清液,利用ELISA技术检测肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的变化情况。用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,通过Western blot方法分别检测其促凋亡因子BAX和抗凋亡因子BCL-2的表达量,用ELISA技术检测细胞培养上清液中TNF-α含量变化情况,用流式细胞仪检测U937细胞的凋亡变化。【结果】鸟分枝杆菌感染U937细胞可引起TLR2、TLR6和TNF-α表达上调;用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,可使U937细胞内促凋亡因子BAX和TNF-α表达量下降(P<0.05),抗凋亡因子BCL-2表达量升高(P<0.05),并可以明显降低感染鸟分枝杆菌后的细胞的凋亡率(P<0.05)。【结论】TLR2和TLR6与巨噬细胞凋亡相关,巨噬细胞通过TLR2和TLR6来识别鸟分枝杆菌,而鸟分枝杆菌反过来通过促进TLR2和TLR6的表达来影响巨噬细胞相关凋亡通路,从而诱导巨噬细胞凋亡。 展开更多

关键词 鸟分枝杆菌 巨噬细胞 TLR2 TLR6 细胞凋亡

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急性髓系白血病患者外周血白细胞长链基因间非编码RNA324(LINC00324)与免疫表型的相关性分析

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作者 刘奕 张洋洋 +4 位作者 谢佳莹 鲍卫 谢彬彬 周吉成 曾祺燕 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期832-837,共6页

目的分析急性髓系白血病(AML)患者外周血白细胞长链基因间非编码RNA324(LINC00324)与免疫表型的关系。方法用实时荧光定量PCR和生物信息学数据库分析AML患者外周血白细胞及KG-1、THP-1、U937细胞株中UNC00324的表达水平,并采用Peraon相... 目的分析急性髓系白血病(AML)患者外周血白细胞长链基因间非编码RNA324(LINC00324)与免疫表型的关系。方法用实时荧光定量PCR和生物信息学数据库分析AML患者外周血白细胞及KG-1、THP-1、U937细胞株中UNC00324的表达水平,并采用Peraon相关分析40例AML患者LINC00324的表达水平与红细胞及血小板计数及LINC00324与免疫表型CD14、CD68、CD64、CDllb、CD4、CD45、CD33、人类白细胞抗原DR(HLA-DR)、CD163、CD2、CD58、CD117、CD43、CD34、CD99、CD8、CD38、CD10、CD13、CD56、CD7、TdT、CD235a、CD138、CD61、髓过氧化物酶(MPO)、CD19的关系。同时选取cBioPortal数据库的数据集(TCGA,NEJM 2013)分析173名AML患者的临床病例数据,分析患者肿瘤样本中LINC00324的表达水平与外周血幼稚细胞百分比及白细胞计数的相关性。结果AML患者外周血白细胞LINC00324表达下调,其表达水平与免疫表型CD33、红细胞及血小板数显著正相关。生物信息学数据库分析显示LINC00324在髓系白血病细胞株中低表达,AML患者中LINC00324表达与CD33、CD117、CDllb、CD14、CD64等多种免疫表型相关,与外周血幼稚细胞百分比及白细胞计数呈负相关。结论UNC00324可能参与调控免疫细胞的分化发育及功能,为AML靶向药物开发或治疗提供新策略。 展开更多

关键词 急性髓系白血病(AML) 长链基因间非编码RNA324(LINC00324) 免疫表型 免疫调控

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雷帕霉素靶蛋白与自噬在衰老中的交互作用 被引量：1

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作者 王俊杰 蓝秀万 吴耀生 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期494-501,共8页

衰老是一个非常复杂的过程,与细胞和组织中累积的各种大分子(DNA、蛋白质和脂质)损伤密不可分,并且是由细胞中不同的信号通道共同调控的结果,而雷帕霉素靶标途径就是其中的一种。该途径整合了各种来自细胞内外的信号以调控细胞的生长、... 衰老是一个非常复杂的过程,与细胞和组织中累积的各种大分子(DNA、蛋白质和脂质)损伤密不可分,并且是由细胞中不同的信号通道共同调控的结果,而雷帕霉素靶标途径就是其中的一种。该途径整合了各种来自细胞内外的信号以调控细胞的生长、增殖和代谢。越来越多证据表明,雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)控制着细胞和组织老化的速度,影响着整个机体衰老过程。另外TOR参与调控自噬的发生,而自噬能使生物大分子和细胞器降解并回收重复利用。多种生物模型研究发现,衰老其实是与自噬的不足有关联。本文对TOR和自噬在衰老过程中的作用和相互关系进行综述,为发展与老年疾病相关的新型治疗方法提供思路。 展开更多

关键词 衰老 寿命 雷帕霉素靶蛋白 自噬

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基于CRISPR/Cas9技术构建与鉴定敲除ACE2基因的Huh7肝癌细胞株 被引量：1

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作者 张祖霖 刘方芳 +3 位作者 周青鸟 赵瑞强 贺菽嘉 林文珍 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期181-188,共8页

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除人Huh7肝癌细胞的血管紧张素转化酶2(ACE2)基因,构建ACE2基因敲除细胞株,为研究ACE2在肝细胞癌的作用提供细胞模型。首先,对ACE2结构域进行鉴定,利用在线网站设计两条破坏所有结构域、靶向作用于ACE2外... 利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除人Huh7肝癌细胞的血管紧张素转化酶2(ACE2)基因,构建ACE2基因敲除细胞株,为研究ACE2在肝细胞癌的作用提供细胞模型。首先,对ACE2结构域进行鉴定,利用在线网站设计两条破坏所有结构域、靶向作用于ACE2外显子的sgRNA。其次,构建重组载体并转染肝癌细胞Huh7,嘌呤霉素筛选出单克隆细胞株。最后,免疫印迹鉴定敲除效果。结构域鉴定结果显示,在340-520号氨基酸位置存在Zn结合位点和激活位点,根据sgRNA靶点设计原则,采用片段敲除的方式,针对ACE2的第9、第10外显子设计两对sgRNA,并成功构建PX459-ACE2-sgRNA重组质粒。嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株,并测序证实了发生片段敲除,ACE2蛋白在敲除细胞株中不表达;成功构建ACE2敲除的Huh7细胞株,为日后研究ACE2在肝细胞癌的发生机制奠定基础。 展开更多

关键词 血管紧张素转化酶2 肝细胞癌 CRISPR-Cas9 单克隆细胞株

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