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蛋白磷酸酶2A促进线粒体自噬减轻果糖诱导的M2型巨噬细胞线粒体氧化损伤
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作者 李晓蔓 蓝利 +5 位作者 龙以瑾 李慧莲 王名鸿 王新航 李习艺 唐深 《陆军军医大学学报》 北大核心 2025年第18期2186-2196,共11页
目的研究果糖暴露对M2型巨噬细胞线粒体氧化损伤的影响,并采用蛋白磷酸酶甲酯化酶-1(protein phosphatase methylesterase-1,PPME-1)抑制剂ABL127特异性激活蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)以阐明其调控作用。方法①以永生... 目的研究果糖暴露对M2型巨噬细胞线粒体氧化损伤的影响,并采用蛋白磷酸酶甲酯化酶-1(protein phosphatase methylesterase-1,PPME-1)抑制剂ABL127特异性激活蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)以阐明其调控作用。方法①以永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞系(Ana-1)为研究对象,设置M0组(常规培养)、M2组(20.00 ng/mL IL-4处理24 h)及M2+梯度果糖处理组(20 ng/mL IL-4联合0.04、0.20、1.00、5.00 mmol/L果糖处理24 h)。采用CCK-8法检测细胞活性,荧光探针法检测线粒体数量、细胞总活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体源ROS及线粒体膜电位水平,Western blot法检测PP2Ac总蛋白(total-PP2Ac)及去甲基化PP2Ac(demethylated-PP2Ac)蛋白表达水平。②设置M0组、M2组、M2+Fru组(20.00 ng/mL IL-4+5.00 mmol/L果糖处理24 h)及M2+Fru+ABL127组(20.00 ng/mL IL-4+5.00 mmol/L果糖+1.00μmol/L ABL127处理24 h)探究PP2A干预机制。荧光探针法检测线粒体与溶酶体数量、ROS及线粒体膜电位水平,Western blot法检测线粒体自噬相关蛋白PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)、自噬底物P62(sequestosome 1,SQSTM1/P62)、微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)及电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)表达,RT-qPCR检测M2型巨噬细胞表型标志物炎症区域分子1(found in inflammatory zone 1,Fizz1)、精氨酸酶1(arginase-1,Arg-1)及转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的mRNA表达。结果①与M2组相比,0.04~5.00 mmol/L梯度果糖处理组在不影响细胞活性前提下呈剂量依赖性诱导M2型巨噬细胞总ROS水平升高(P<0.05),果糖浓度达5.00 mmol/L时线粒体源ROS及线粒体数量增加(P<0.05),线粒体膜电位水平下降(P<0.05),同时Total-PP2Ac未见改变,而Demethylated-PP2Ac蛋白表达显著上调(P<0.05)。②与M2+Fru组相比,M2+Fru+ABL127组线粒体数量减少、溶酶体数量增加(P<0.01),线粒体自噬相关蛋白PINK1、LC3Ⅱ及VDAC表达均上调(P<0.05),自噬底物P62表达下调(P<0.05),总体及线粒体源ROS水平降低、线粒体膜电位上升(P<0.01);与M2组相比,M2+Fru组标志物Fizz1、Arg-1及TGF-β的mRNA表达下降(P<0.05),ABL127干预后上述标志物表达升高(P<0.05)。结论果糖诱导M2型巨噬细胞PP2Ac去甲基化造成线粒体氧化损伤,激活PP2A显著促进线粒体自噬以逆转该损伤。 展开更多
关键词 果糖 巨噬细胞 线粒体自噬 氧化应激 蛋白磷酸酶2A
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黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体的制备和应用 被引量:5
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作者 贺菽嘉 顾永耀 +5 位作者 肖绍文 张庆梅 陈芳 罗彬 付骏 谢小薰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期104-108,共5页
目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶... 目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶柱亲和层析法纯化后,通过SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA、Western blot法检测抗体的效价及特异性;免疫组织化学染色法检测肺癌组织中MAGE-D4的表达及定位。结果获得纯度较高的抗MAGE-D4多克隆抗体,ELISA检测抗体的效价为1∶256 000,Western blot法分析显示MAGE-D4多克隆抗体可特异性识别MAGE-D4重组蛋白,免疫组织化学结果表明,该抗体能识别肺癌组织中的内源性MAGE-D4蛋白,表达的阳性率为69.6%(17/23)。结论制备的MAGE-D4多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度。 展开更多
关键词 黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4) 多克隆抗体 肿瘤相关抗原
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绿原酸抑制糖酵解及脂肪酸代谢调控M1型巨噬细胞极化 被引量:11
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作者 蓝春花 孟玲 +6 位作者 陈成英 蓝利 王新航 常升搏小吉 陆彩玲 李习艺 唐深 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第20期2440-2444,共5页
目的:探讨绿原酸对脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFN-γ)诱导的M1型巨噬细胞炎症反应的调控,并初步探索糖酵解及脂肪酸代谢在其中的作用机制。方法:THP-1细胞经佛波酯(PMA)处理24 h极化为M0型巨噬细胞;M1型极化组:经10 ng/ml LPS和20 ng/ml I... 目的:探讨绿原酸对脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFN-γ)诱导的M1型巨噬细胞炎症反应的调控,并初步探索糖酵解及脂肪酸代谢在其中的作用机制。方法:THP-1细胞经佛波酯(PMA)处理24 h极化为M0型巨噬细胞;M1型极化组:经10 ng/ml LPS和20 ng/ml IFN-γ刺激48 h,M0型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞;绿原酸处理组:M1型巨噬细胞极化诱导开始时,分别加入50μg/ml、100μg/ml绿原酸培养48 h。倒置显微镜观察细胞形态的变化,实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞极化和脂肪酸合成的相关基因:IL-6、TNF-α、环加氧酶2(COX-2)、CXC趋化因子配体-10(CXCL-10)、固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)、氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)的mRNA表达水平;微量法试剂盒检测糖酵解相关酶——己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果:M0极化为M1时,细胞伪足增多,呈梭形或不规则形,M1型极化相关基因IL-6、TNF-α、COX-2、CXCL-10和脂肪酸合成相关基因PPAR-γ、SREBP-1 mRNA表达水平明显升高,HK、PK、LDH活性增加;50μg/ml绿原酸处理组梭形细胞和伪足明显减少,其极化相关基因IL-6、TNF-α、COX-2、CXCL-10和脂肪酸合成相关基因PPAR-γ、SREBP-1的mRNA水平明显降低,HK、PK、LDH的活性下降,100μg/ml绿原酸处理较50μg/ml作用更强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:绿原酸可能通过抑制巨噬细胞糖酵解和脂肪酸代谢途径,下调M1型巨噬细胞极化相关标志物的表达,调控M1型巨噬细胞炎症极化。 展开更多
关键词 绿原酸 M1型巨噬细胞 糖酵解 脂肪酸代谢 极化
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胶质瘤中LINC01152的表达及其对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响 被引量:2
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作者 李鑫 刘畅 +7 位作者 薛春红 王平 李枫 葛盈盈 农蔚霞 张庆梅 谢小薰 罗彬 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第4期622-629,共8页
目的 探讨长链非编码RNA LINC01152在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响。方法 应用LncSpA V2.0和GEPIA数据库分析LINC01152在胶质瘤中的表达;qRT-PCR检测10例正常脑组织、40例胶质瘤组织和5株胶质瘤细胞系中LINC0115... 目的 探讨长链非编码RNA LINC01152在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响。方法 应用LncSpA V2.0和GEPIA数据库分析LINC01152在胶质瘤中的表达;qRT-PCR检测10例正常脑组织、40例胶质瘤组织和5株胶质瘤细胞系中LINC01152 mRNA的表达。使用DAVID数据库对LINC01152共表达基因进行GO和KEGG富集分析,预测其功能。通过AnnoLnc2、TargetScan、LinkedOmics和miRDB数据库预测并筛选LINC01152相关miRNA和靶基因,构建ceRNA调控网络。利用小干扰RNA在胶质瘤细胞系下调LINC01152表达,通过CCK-8法测试、划痕愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验、流式细胞术、Western blot等检测LINC01152对胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等功能的影响。结果 数据库分析显示,与其他肿瘤类型相比,LINC01152在胶质母细胞瘤(GBM)和低级别胶质瘤(LGG)中高表达,且高于正常脑组织。qRT-PCR结果显示LINC01152 mRNA在胶质瘤组织中的表达显著高于正常脑组织(P<0.01)。LINC01152的表达与Ki-67相关(P<0.05),但与胶质瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小、P53蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)和WHO分级等临床参数无关。共表达基因的功能富集分析表明,LINC01152主要参与细胞黏附和突触信号传导等生物学过程。根据预测的靶基因构建LINC01152-miRNA-mRNA调控网络。LINC01152表达下调后,A172和U87细胞的增殖、迁移、侵袭能力降低(P<0.01),而凋亡细胞数量增加(P<0.001)。结论 LINC01152在胶质瘤中高表达,通过促进胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和抑制凋亡等途径促进胶质瘤的恶性生物学行为。 展开更多
关键词 LncRNA 胶质瘤 恶性生物学行为
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白脂素包涵体表达纯化及其功能评价
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作者 韦雪静 敖青青 +5 位作者 孟玲 徐怡璐 陆彩玲 唐深 王新航 李习艺 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期67-72,共6页
目的构建白脂素的原核表达质粒,表达及纯化重组白脂素蛋白,并初步探索其功能,为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,梯度尿素复性,亲和层析纯化... 目的构建白脂素的原核表达质粒,表达及纯化重组白脂素蛋白,并初步探索其功能,为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,梯度尿素复性,亲和层析纯化及去内毒素处理得到可用于细胞和动物实验的重组白脂素。采用血糖仪检测重组白脂素腹腔注射后C57小鼠血糖变化情况。Alamar Blue检测重组白脂素作用24 h对MIHA细胞活性的影响;重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,用蒽酮法检测糖原含量。结果在37℃,A600 nm=0.8,IPTG终浓度为1 mmol/L诱导4 h目的蛋白表达效果较好。通过纯化和去内毒素处理,重组白脂素纯度大于95%,内毒素含量小于1 EU/mg,可以用于动物与细胞实验。腹腔注射重组白脂素60 min后C57小鼠血糖升高至峰值(重组白脂素组vs对照组P=0.021),120 min恢复到正常水平(重组白脂素组vs对照组P=0.03)。重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,对细胞活性没有影响;检测糖原发现,不同浓度白脂素组糖原与对照组比较差异有统计学意义(P1=0.013,P2=0.036,P3=0.011)。结论通过原核表达系统成功表达及纯化了白脂素蛋白,该方法纯化后的白脂素具有降低MIHA细胞糖原含量及升高小鼠血糖的作用,这为白脂素功能的进一步研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 原核表达与纯化 包涵体 白脂素 糖原分解 血糖
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