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一株卵形鲳鲹肠道源粪肠球菌的分离鉴定与生物学特性研究 被引量：1
1
作者 张霄 李一 +4 位作者 喻大鹏 黄瑜 王蓓 简纪常 蔡佳 《广东农业科学》 CAS 2024年第7期47-56,共10页
【目的】近年来鱼源益生菌在水产养殖中的应用越来越广泛,然而卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)源的益生菌鲜有报道。从卵形鲳鲹中分离潜在益生菌并对其生物学特性进行分析,为该菌株在卵形鲳鲹中的应用提供理论基础。【方法】无菌采集健康... 【目的】近年来鱼源益生菌在水产养殖中的应用越来越广泛,然而卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)源的益生菌鲜有报道。从卵形鲳鲹中分离潜在益生菌并对其生物学特性进行分析,为该菌株在卵形鲳鲹中的应用提供理论基础。【方法】无菌采集健康卵形鲳鲹肠道内容物,进行细菌分离与鉴定;对典型菌落做形态观察、革兰染色、生化鉴定、16S rRNA基因序列分析、药敏试验、耐盐能力试验、产酸能力及生长曲线测定和毒力基因鉴定。【结果】根据分离菌株的形态特征、革兰染色、生化特性和16S rRNA基因测序结果比对,分离菌株与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)相似度达100%,确定其为粪肠球菌。该菌株菌落呈淡灰白色,为革兰氏阳性球菌,七叶苷、纤维二塘、麦芽糖、甘露醇、水杨苷等生化检测结果均显示阳性。药敏试验结果表明,分离菌株对哌拉西林、多粘菌素B、青霉素、复方新诺明、苯唑西林等药物呈现出不同程度的耐药性;对环丙沙星、麦迪霉素、头孢曲松呈中等敏感,对万古霉素、头孢哌酮、氧氟沙星等11种药物敏感。分离菌株可在0%~8%NaCl浓度下生长,具有一定耐盐性。产酸能力和生长曲线测定结果表明,随着菌株大量繁殖,菌液pH值快速下降,其产酸能力增强。毒力基因鉴定结果表明,分离菌株包含efaA、agg、as、fsrA 4种毒力基因。【结论】该研究成功从卵形鲳鲹肠道内分离到一株潜在益生菌菌株,鉴定为粪肠球菌。该菌株具有良好的耐盐和产酸能力,并含有与肠道黏附相关的毒力基因,可为该菌株的后续应用奠定基础。 展开更多
关键词 卵形鲳鲹 粪肠球菌 益生菌 生化特性 毒力基因 耐盐 产酸能力
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酸枣仁醇提物及白桦脂酸抗神经坏死病毒的作用机制
2
作者 徐伟强 玉洁莹 +7 位作者 黄琳 余庆 刘明珠 王劭雯 孙云 韩书煜 秦启伟 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1787-1801,共15页
【目的】探究酸枣仁醇提物(SZSE)及其活性成分白桦脂酸(BA)抗鱼类神经坏死病毒(NNV)的作用机制,为研发绿色、高效、无污染的抗NNV渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光试验确定SZSE及其活性成分BA的... 【目的】探究酸枣仁醇提物(SZSE)及其活性成分白桦脂酸(BA)抗鱼类神经坏死病毒(NNV)的作用机制,为研发绿色、高效、无污染的抗NNV渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光试验确定SZSE及其活性成分BA的细胞安全工作浓度,再利用光学显微镜观察、结晶紫染色及实时荧光定量PCR检测SZSE及其活性成分BA的抗NNV效果,并以实时荧光定量PCR探析二者的抗NNV作用机制。【结果】SZSE及其活性成分BA的细胞安全工作浓度分别为:SZSE≤50μg/mL,BA≤6.25μg/mL,且50μg/mL SZSE或6.25μg/mL BA对卵形鲳鲹脾脏成纤维细胞(TOSF)无毒性作用。NNV与50、25、12.5μg/mL的SZSE或6.25、3.125、1.5625μg/mL的BA分别共孵育TOSF细胞,48 h后发现药物处理的TOSF细胞病变效应(CPEs)明显低于NNV组;结晶紫染色发现药物处理后活的TOSF细胞数量也明显多于NNV组;实时荧光定量PCR检测结果表明,经药物处理后TOSF细胞中NNV的CP基因相对表达量均极显著低于NNV组(P<0.01),且呈剂量依赖关系。SZSE及其活性成分BA在NNV感染前后2 h分别处理TOSF细胞均具有抗病毒效果,表明SZSE及其活性成分BA不仅具有预防病毒感染的作用,还能用于治疗病毒感染。此外,SZSE及其活性成分BA通过与NNV粒子相互作用、干扰NNV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制阶段,以及调控CAT、GSH-Px、HO-1、TGF、Keap1和Nrf2等免疫相关基因的表达,而发挥抗病毒作用。【结论】SZSE及其活性成分BA具有抑制NNV感染的功能,不仅能干扰NNV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制阶段,还通过调控免疫相关基因的表达而发挥抗病毒作用。可见,SZSE及其活性成分BA具有开发为绿色、高效抗NNV渔用药物的潜力。 展开更多
关键词 酸枣仁醇提物(SZSE) 白桦脂酸(BA) 神经坏死病毒(NNV) 抗病毒 安全工作浓度
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单宁酸抗大口黑鲈弹状病毒的作用机制
3
作者 玉洁莹 顾屹 +7 位作者 黄琳 王浩 余庆 刘明珠 韩书煜 秦启伟 凌飞 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1823-1833,共11页
【目的】从大口黑鲈弹状病毒(MSRV)感染细胞的生命周期探究单宁酸在MSRV感染过程中的潜在作用机制,为研发高效安全的抗MSRV渔用药物提供理论依据。【方法】以胖头鱥肌肉细胞系(FHM)为模型,通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光染色... 【目的】从大口黑鲈弹状病毒(MSRV)感染细胞的生命周期探究单宁酸在MSRV感染过程中的潜在作用机制,为研发高效安全的抗MSRV渔用药物提供理论依据。【方法】以胖头鱥肌肉细胞系(FHM)为模型,通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光染色分析单宁酸毒性,确定其安全工作浓度;然后使用结晶紫染色评估单宁酸对MSRV的抑制作用,利用实时荧光定量PCR检测单宁酸体外抗MSRV效果及探析其作用机制,包括单宁酸对MSRV粒子及MSRV吸附宿主细胞表面、侵入细胞与细胞内复制各阶段的影响。【结果】综合光学显微镜观察与CCK-8检测结果,确定单宁酸对FHM细胞的安全工作浓度为0.0125 mg/mL;以0.0125 mg/mL单宁酸孵育36 h后,FHM细胞的骨架结构仍然保持完整,未观察到核膜皱缩或染色质凝聚等异常现象。将0.0125、0.00625和0.003125 mg/mL的单宁酸分别与MSRV共孵育处理,能有效降低MSRV感染FHM细胞产生的病变效应,且FHM细胞中MSRV的N基因相对表达量极显著低于未经单宁酸处理的MSRV感染细胞(P<0.01,下同)。在经单宁酸处理的MSRV感染FHM细胞中,MSRV的N基因相对表达量和病毒滴度均极显著低于未经单宁酸处理的MSRV感染FHM细胞,即单宁酸可直接作用于MSRV粒子,致使其感染能力降低。此外,在MSRV感染的吸附、侵入和复制各阶段以单宁酸进行处理,FHM细胞中MSRV的N基因相对表达量均极显著低于未经单宁酸处理的MSRV感染细胞,即单宁酸通过干扰MSRV感染过程的吸附、侵入与复制而发挥抗病毒作用。【结论】单宁酸对MSRV具有良好的抗病毒作用,可直接作用于MSRV粒子,且对MSRV的吸附、侵入与复制各阶段均有抑制作用,具有开发成高效安全抗MSRV渔用药物的潜力。 展开更多
关键词 大口黑鲈弹状病毒(MSRV) 单宁酸 抗病毒机制 细胞病变效应
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基于核酸适体功能化纳米磁珠的石斑鱼虹彩病毒检测
4
作者 夏悦婷 余庆 +10 位作者 黄琳 黄静 覃向谋 赵明明 韦冬冬 王浩 凌飞 常彦磊 许伟江 刘明珠 李鹏飞 《广东海洋大学学报》 北大核心 2025年第3期21-27,共7页
【目的】开发一种基于核酸适体功能化纳米磁珠的石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)快速检测新方法,以解决传统病毒检测技术操作繁琐、耗时长、设备依赖性强等问题。【方法】将前期筛选获得的可特异性识别SGIV的核酸适... 【目的】开发一种基于核酸适体功能化纳米磁珠的石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)快速检测新方法,以解决传统病毒检测技术操作繁琐、耗时长、设备依赖性强等问题。【方法】将前期筛选获得的可特异性识别SGIV的核酸适配体进行优化及修饰,获得核酸适配体Q5c,并将其与纳米磁珠进行偶联,构建核酸适配体偶联磁性纳米探针(Aptamer magnetic nanobeads,Q5c-MNPs)。利用多病原交叉实验验证Q5c-MNPs对SGIV感染细胞的特异性靶向识别,采用流式细胞术、荧光定量PCR等技术系统评价探针的稳定性、灵敏度等关键性能指标。【结果】Q5c-MNPs可特异性识别SGIV感染的细胞,并在500 nmol/L浓度下孵育时间短至1 min,在4~37℃温度范围内检测性能稳定。检测灵敏度达1×10^(3)个/mL,与RT-qPCR检测灵敏度相当。而本方法检测周期仅需2h,较常规分子检测方法效率显著提升。【结论】成功构建Q5c-MNPs检测体系,该体系兼具高特异性、高灵敏度和快速响应等优势,为开发水产病害现场快速检测试剂盒奠定重要技术基础。 展开更多
关键词 石斑鱼虹彩病毒 核酸适配体Q5c 纳米磁珠 快速检测
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激活式核酸适配体LYGV1c对石斑鱼虹彩病毒的特异性识别与检测
5
作者 刘明珠 谢瑾琨 +7 位作者 余庆 黄静 王一兵 徐继卫 常彦磊 黄广杰 韩书煜 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1704-1714,F0002,共12页
【目的】构建能特异性识别石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的激活式核酸适配体探针,为开发特异性识别SGIV的快速检测试剂盒提供技术支持,实现对SGIV感染的早期诊断及精准防控。【方法】基于可特异性识别SGIV感染宿主细胞的核酸适配体LYGV1,通过加... 【目的】构建能特异性识别石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的激活式核酸适配体探针,为开发特异性识别SGIV的快速检测试剂盒提供技术支持,实现对SGIV感染的早期诊断及精准防控。【方法】基于可特异性识别SGIV感染宿主细胞的核酸适配体LYGV1,通过加入T链、C链、荧光基团及淬灭基团等功能化修饰,成功构建获得靶标激活式核酸适配体TAA-LYGV1c;然后通过流式细胞仪分析、激光共聚焦显微镜观察及实时荧光定量PCR等技术系统验证TAALYGV1c对SGIV的特异性识别能力,并对其最适工作浓度、孵育时间、孵育温度及识别靶细胞检测限等条件进行优化,以评估TAA-LYGV1c的可操作性;最后构建SGIV感染模型,通过流式细胞仪检测分析和实时荧光定量PCR进一步探究TAA-LYGV1c在实际生产中的应用价值。【结果】加入TAA-LYGV1c后SGIV感染组石斑鱼脾脏(GS)细胞的荧光值极显著高于未加入TAA-LYGV1c的SGIV感染组(P<0.01,下同),同时极显著高于空白对照组和神经坏死病毒(NNV)感染组,说明TAA-LYGV1c可特异性识别SGIV感染。TAA-LYGV1c的最适工作浓度为500 nmol/L,最适孵育温度为28℃,最短孵育1 min即可检测到荧光。不同检测方法的最低检测限存在一定差异,其中,流式细胞仪检测分析TAA-LYGV1c识别靶细胞的检测限为5×10^(3)个/mL,荧光酶标仪检测分析的最低检测限与实时荧光定量PCR检测的最低检测限均为500个/mL,即检测灵敏度与仪器的检测原理存在一定关联。在活体检测中,基于TAA-LYGV1c的流式细胞仪检测分析结果与实时荧光定量PCR检测结果一致,进一步证实TAA-LYGV1c能特异性识别SGIV感染,也说明核酸适配体在水产养殖病原检测方面具有潜在的应用价值。【结论】开发的激活式核酸适配体TAA-LYGV1c具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势,可实现对SGIV感染的早期快速诊断,为开发特异性识别SGIV的快速检测试剂盒提供技术支持。 展开更多
关键词 石斑鱼虹彩病毒(SGIV) 核酸适配体 TAA-LYGV1c 快速检测
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肉桂醇提物对大口黑鲈虹彩病毒的体外抗病毒作用 被引量：2
6
作者 廖文钰 竺利波 +7 位作者 刘明珠 余庆 玉洁莹 陈嘉 韦云依 黄吉利 黄琳 李鹏飞 《广东海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期17-24,共8页
【目的】探究肉桂醇提物在大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(LMBV)感染中的抗病毒效果及作用机制,为开发抗LMBV药物提供参考。【方法】采用CCK-8试剂盒检测、结晶紫染色观察、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测、病毒滴度[半数组织... 【目的】探究肉桂醇提物在大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(LMBV)感染中的抗病毒效果及作用机制,为开发抗LMBV药物提供参考。【方法】采用CCK-8试剂盒检测、结晶紫染色观察、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测、病毒滴度[半数组织培养感染剂量(TCID50)]测定等方法确定肉桂醇提物在胖头鱥肌肉细胞系(FHM)上的安全工作浓度,评估肉桂醇提物在细胞水平对LMBV的抗病毒效果,分析其抗LMBV机制。【结果】肉桂醇提物在≤12.5μg/mL的质量浓度范围内对FHM细胞无明显毒性。FHM细胞与LMBV以及质量浓度分别为12.5、6.25、3.125μg/mL肉桂醇提物共孵育后,细胞病变明显减少,结晶紫染色后可见活细胞数明显升高,MCP、ICP46基因的表达量显著降低(P<0.01),且抗病毒效果有剂量依赖性。12.5μg/mL肉桂醇提物与LMBV共孵育后接入FHM细胞,细胞中MCP、ICP46基因的相对表达量以及TCID_(50)极显著下降(P<0.01);FHM细胞与经肉桂醇提物处理的LMBV共孵育后,细胞中LMBV MCP和ICP46基因的相对表达量显著低于未用肉桂醇提物处理的LMBV感染组(P<0.01);在LMBV感染FHM细胞后,接入肉桂醇提物的FHM细胞中MCP和ICP46基因的相对表达量显著下降(P<0.05);在LMBV感染FHM细胞3 h后用肉桂醇提物处理8 h的FHM细胞中MCP和ICP46基因的相对表达量显著下调(P<0.05)。【结论】肉桂醇提物可降低LMBV的感染力,干扰LMBV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制,有良好的抗LMBV作用,可作为环保、高效的抗LMBV渔用药物候选者。 展开更多
关键词 大口黑鲈 虹彩病毒 肉桂 抗病毒作用 渔用药物
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尼罗罗非鱼S100A16基因克隆及其功能分析 被引量：1
7
作者 陈钊峰 苏海明 +4 位作者 黄瑜 鲁义善 王蓓 简纪常 蔡佳 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期2614-2623,共10页
【目的】研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)钙结合蛋白S100A16的结构特征、系统进化关系及组织表达分布情况等,进一步分析S100A16在抗菌免疫中的作用,为深入研究S100A16基因在鱼类免疫防御中的功能提供参考依据。【方法】根据S100... 【目的】研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)钙结合蛋白S100A16的结构特征、系统进化关系及组织表达分布情况等,进一步分析S100A16在抗菌免疫中的作用,为深入研究S100A16基因在鱼类免疫防御中的功能提供参考依据。【方法】根据S100A16基因序列设计特异性引物克隆尼罗罗非鱼S100A16基因(On-S100A16),构建原核表达载体并采用SMART 4.0、DNAMAN 9.0及MEGA 6.0等在线软件对On-S100A16氨基酸序列进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR检测On-S100A16在尼罗罗非鱼各组织中的分布情况及无乳链球菌感染后在尼罗罗非鱼各组织中的表达变化,并制备融合蛋白用于孵育尼罗罗非鱼头肾淋巴细胞后,检测炎症相关因子基因的表达情况。【结果】克隆获得的On-S100A16基因编码区长度为276 bp,共编码91个氨基酸残基,含有S100保守结构域。On-S100A16氨基酸序列与斑马拟丽鱼、杂色鳉、大口黑鲈等其他鱼类的S100A16氨基酸序列具有较高的相似度,系统发育进化分析也显示On-S100A16与斑马拟丽鱼S100A16的亲缘关系最近。On-S100A16基因在尼罗罗非鱼的各组织中广泛表达,在肝脏组织中的相对表达量最高;经无乳链球菌感染后,On-S100A16基因在尼罗罗非鱼脑、肠道和脾脏组织中的表达量呈上调趋势,且均在感染24 h后达峰值。成功制备融合蛋白S100A16后用于孵育头肾淋巴细胞,实时荧光定量PCR检测结果表明,抗炎因子基因IL-4和TLR1的相对表达量极显著上调(P<0.01,下同),促炎因子基因IL-6和TNF-α的相对表达量则极显著下调。【结论】On-S100A16氨基酸序列含有S100蛋白家族典型的S100结构域,其可能具有与其他S100蛋白相似的生物学功能。On-S100A16通过调控淋巴细胞活性来参与尼罗罗非鱼的抗菌免疫反应。 展开更多
关键词 尼罗罗非鱼 S100A16 融合蛋白 淋巴细胞 抗菌免疫
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八角茴香水提物调控宿主免疫反应抗石斑鱼虹彩病毒的机制研究 被引量：6
8
作者 李梦梦 韦红玲 +4 位作者 刘明珠 黄帅帅 王太霞 黄琳 李鹏飞 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期2756-2765,共10页
【目的】从免疫应答角度探析八角茴香(Illicium verum Hook.f.)水提物(IVE)调控宿主免疫反应而发挥抗石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的作用机制,为八角茴香应用于石斑鱼健康养殖产业及开发绿色、健康、高效渔用药物提供理论依据。【方法】通过光... 【目的】从免疫应答角度探析八角茴香(Illicium verum Hook.f.)水提物(IVE)调控宿主免疫反应而发挥抗石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的作用机制,为八角茴香应用于石斑鱼健康养殖产业及开发绿色、健康、高效渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察及CCK-8细胞活力测定确定IVE的细胞安全工作浓度,利用实时荧光定量PCR检测IVE对宿主细胞干扰素相关基因(IFN、STAT1、PKR、ISG15、KKα、STING和IRF3)表达的影响,并以光学显微镜观察和实时荧光定量PCR分析IVE在细胞水平抗SGIV的效果,通过石斑鱼活体试验进一步验证IVE的抗SGIV效果。【结果】IVE细胞水平的安全工作浓度≤0.50 mg/mL;IVE预处理GS细胞2 h可显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)激活干扰素相关基因(IFN、STAT1、PKR、IKKα、IRF3和STING)的表达。SGIV感染GS细胞24和48 h时,经IVE预处理的细胞病变效应(CPEs)明显少于未使用IVE预处理的GS细胞,且细胞内SGIV的MCP基因相对表达量极显著降低,表明IVE可有效抑制SGIV感染;此外,IVE可增强SGIV感染GS细胞中干扰素相关基因的表达,具体表现为IFN、STAT1和IRF3基因在病毒感染后24 h极显著上调,PKR、IKKα、ISG15和STING基因在病毒感染后24和48 h呈显著或极显著上调趋势。在石斑鱼活体试验中,IVE与SGIV混合腹腔注射后石斑鱼脾脏中SGIV的MCP基因相对表达量在病毒感染后24和48 h均极显著低于仅注射SGIV的石斑鱼。【结论】IVE具有抑制SGIV感染的功能,其作用机制可能是通过诱导干扰素相关基因表达而激活宿主的抗病毒状态,从而发挥间接抗SGIV效果;也说明八角茴香在水产疫病防控中具有研发成渔用抗病功能制剂的潜力。 展开更多
关键词 石斑鱼虹彩病毒(SGIV) 八角茴香水提物(IVE) 免疫反应 抗病毒机制 干扰素
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