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碱性土壤微生物基因的克隆和多样性分析 被引量：7
1
作者 胡婷婷 蒋承建 +2 位作者 梁璇 隆文杰 武波 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1287-1293,共7页
从碱性土壤样品中直接抽提和分离宏基因组DNA,首先构建了包含5562个阳性克隆的碱性土壤16SrDNA文库,随机抽取9个克隆测序后构建的系统进化树表明了碱性土壤环境微生物种群基因的多样性。纯化土壤宏基因组DNA后采用EcoRⅠ酶部分酶切处理... 从碱性土壤样品中直接抽提和分离宏基因组DNA,首先构建了包含5562个阳性克隆的碱性土壤16SrDNA文库,随机抽取9个克隆测序后构建的系统进化树表明了碱性土壤环境微生物种群基因的多样性。纯化土壤宏基因组DNA后采用EcoRⅠ酶部分酶切处理,我们又构建了以pGEM-3Zf(+)为载体的DNA部分文库AL01。AL01文库包含23650个克隆,随机插入载体的外源DNA片段平均大小为3.2kb左右,DNA文库的总容量为75.68Mb。建库效率为从每克环境样品中获得6000个左右的含随机外源DNA片段插入载体的克隆。采用酶活筛选策略,我们从AL01文库中筛选到一个编号为pGXAA2011的阳性克隆携带有一个完整的碱性蛋白酶基因。蛋白酶活性检测其酶活作用最佳温度为40℃,最适作用pH值为9.5。另外,我们还克隆和表达了一个新型-葡萄糖苷酶基因unglu01,该基因和现有数据库中的-葡萄糖苷酶基因没有任何DNA或者氨基酸水平的同源性。将unglu01基因的ORF与表达载体pETBlue-2连接后导入宿主菌株Tuner(DE3)pLacI中,该重组表达克隆在含柠檬酸高铁铵和七叶苷的LA平板上表现清晰的-葡萄糖苷酶活性,SDS-PAGE电泳可以检测到29kDa大小的目的蛋白。 展开更多
关键词 宏基因组 文库 未培养微生物 碱性蛋白酶 Β-葡萄糖苷酶
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高产生物丁醇新菌株的筛选、鉴定及发酵研究 被引量：9
2
作者 裴建新 左文朴 +4 位作者 庞浩 张穗生 黄志民 黎贞崇 黄日波 《可再生能源》 CAS 北大核心 2011年第5期99-102,共4页
丁醇是具有巨大应用潜力的可再生能源。为了获得高效生产丁醇的菌株,通过玉米培养基富集、丁醇耐受筛选的方法,从自然环境(牛粪、沼气池和土壤)来源的60份样品中分离获得1株丁醇发酵比率高的新菌株,菌株命名为gxzp-13-2。经梯度浓度葡... 丁醇是具有巨大应用潜力的可再生能源。为了获得高效生产丁醇的菌株,通过玉米培养基富集、丁醇耐受筛选的方法,从自然环境(牛粪、沼气池和土壤)来源的60份样品中分离获得1株丁醇发酵比率高的新菌株,菌株命名为gxzp-13-2。经梯度浓度葡萄糖发酵试验表明,5%葡萄糖发酵丁醇产量较高,最高可达10.05 g/L,总溶剂达到13.95 g/L,丁醇比约为72.1%,转化率为31.8%。对此菌株进行了分子鉴定,经16S rDNA基因序列同源性分析表明,gxzp-13-2与拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的同源性最高,相似性高达98%。gxzp-13-2在厌氧固体培养基上生长,菌落呈紫色。该菌株为下一步的菌种基因改造工作提供了研究基础,也为丁醇发酵提供了宝贵的菌种资源。 展开更多
关键词 拜氏梭菌 生物丁醇 鉴定 发酵
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两株高丁醇耐受细菌的分离鉴定及其丁醇耐受特性的研究 被引量：3
3
作者 左文朴 裴建新 +1 位作者 庞浩 黄日波 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期155-159,共5页
高浓度丁醇耐受菌株是丁醇异源重组生产的关键因素。本研究对不同环境中耐受丁醇的微生物进行筛选,从自然环境中分离得到两株能够耐受高浓度丁醇的菌株,分别命名为btpz-4-1和btpz-6-3,它们耐受丁醇的浓度达到了25g/L。通过分子标记物16S... 高浓度丁醇耐受菌株是丁醇异源重组生产的关键因素。本研究对不同环境中耐受丁醇的微生物进行筛选,从自然环境中分离得到两株能够耐受高浓度丁醇的菌株,分别命名为btpz-4-1和btpz-6-3,它们耐受丁醇的浓度达到了25g/L。通过分子标记物16S rDNA的鉴定以及分子系统进化树的分析,btpz-4-1被鉴定为Lactobacillus mucosae,btpz-6-3被鉴定为Pedi-ococcus pentosaceus。同时,对它们的生理特性进行研究,结果显示btpz-4-1和btpz-6-3的最适生长温度分别为45℃和42℃,最适生长pH分别为6.0和6.5。 展开更多
关键词 丁醇耐受 分离 鉴定 16S RDNA
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perR基因的敲除对丙酮丁醇梭菌摇瓶发酵的影响 被引量：2
4
作者 裴建新 庞浩 +4 位作者 左文朴 林丽华 郭媛 严少敏 黄日波 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期94-98,共5页
为了提高丙酮丁醇梭菌对分子氧的耐受能力,降低厌氧发酵环境,构建了超氧化物阻遏蛋白(PERR)基因敲除的工程菌株。应用Ⅱ组内含子敲除系统,PCR克隆perR-Targetron基因与载体连接构建敲除质粒pSYperR,电转化丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ... 为了提高丙酮丁醇梭菌对分子氧的耐受能力,降低厌氧发酵环境,构建了超氧化物阻遏蛋白(PERR)基因敲除的工程菌株。应用Ⅱ组内含子敲除系统,PCR克隆perR-Targetron基因与载体连接构建敲除质粒pSYperR,电转化丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 824,PCR筛选验证获得突变菌株C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR,采用摇瓶发酵对其突变菌株进行发酵性能研究。结果表明:静止状态发酵丁醇C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR比C.acetobutylicum ATCC 824丁醇产量提高7.89%,摇床转速为200 r/min时,C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR的丁醇产量是C.acetobutylicum ATCC 824的3.34倍。研究表明,通过Ⅱ组内含子敲除系统,构建的C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR在发酵过程中降低了氧分子的伤害,不需要严格的厌氧条件,从而降低发酵成本。 展开更多
关键词 丙酮丁醇梭菌 Ⅱ组内含子 丁醇 敲除
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褐色喜热裂孢菌Thermobifida fusca产麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究 被引量：1
5
作者 薛蓓 王治宾 +1 位作者 刘振东 韦宇拓 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第24期214-218,231,共6页
以T.fusca基因组DNA为模板,PCR分别扩增不包括和包括其基因前段信号肽的产麦芽糖淀粉酶的基因片段tfa和sptfa,并克隆至表达载体pSE380上,获得重组质粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa,以大肠杆菌JM109为宿主细胞大量表达融合蛋白,利用金属镍... 以T.fusca基因组DNA为模板,PCR分别扩增不包括和包括其基因前段信号肽的产麦芽糖淀粉酶的基因片段tfa和sptfa,并克隆至表达载体pSE380上,获得重组质粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa,以大肠杆菌JM109为宿主细胞大量表达融合蛋白,利用金属镍亲和层析对菌株JM109/pSE380-tfa表达的α-淀粉酶进行纯化,SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为64ku,K m值为1.305mg/mL,最适反应温度为60℃,最适pH为7.0;检测到菌株JM109/pSE380-sptfa的培养基上清有相当一部分酶活。本研究麦芽糖α-淀粉酶与可溶性淀粉反应,经HPLC检测产物均为麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物。因此麦芽糖α-淀粉酶在生产高麦芽糖浆上起到了一定的作用。 展开更多
关键词 褐色喜热裂孢菌 麦芽糖α-淀粉酶基因 信号肽 克隆表达 麦芽糖 酶学性质
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地芽孢杆菌Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶的饱和突变及酶学性质研究
6
作者 薛蓓 裴建新 +2 位作者 王治宾 罗章 韦宇拓 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期153-159,共7页
采用半理性设计方法,在网站Geno3D上以PDB数据库中B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶(BSMA)的三维结构为模板,对AMY(α-淀粉酶)进行三维结构同源建模(二者氨基酸的同源性为33%)。比较同源建模预测的3D结构和模板BSMA的3D结构关键位点,... 采用半理性设计方法,在网站Geno3D上以PDB数据库中B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶(BSMA)的三维结构为模板,对AMY(α-淀粉酶)进行三维结构同源建模(二者氨基酸的同源性为33%)。比较同源建模预测的3D结构和模板BSMA的3D结构关键位点,在此基础上通过计算机辅助设计软件ProSa2003,根据能量变化确定了AMY三个饱和突变位点:D192、E221和D289。利用兼并引物对AMY的假定活性中心位点D192、E221和D289的氨基酸分别进行饱和突变,定点(饱和)突变库筛选得到4个有活力的突变子D192A、E221N、E221L和D289L,并对突变酶的酶学性质进行初步研究。 展开更多
关键词 地芽孢杆菌 Α-淀粉酶 酶学性质 饱和突变
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海洋源纤溶酶高产菌株的诱变育种及液体培养基优化 被引量：2
7
作者 刘延廖 漆光辉 +3 位作者 李培玲 梁智群 陈桂光 曾伟 《中国酿造》 CAS 北大核心 2016年第12期53-58,共6页
为获得纤溶酶高产菌株及其最优发酵条件,以海洋环境来源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H-A-03为出发菌株,经过^(60)Co辐射诱变获得了一株遗传稳定性好的纤溶酶高产菌株F8-C,其酶活力较出发菌株提高28.78%。采用统计学优化方法获得... 为获得纤溶酶高产菌株及其最优发酵条件,以海洋环境来源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H-A-03为出发菌株,经过^(60)Co辐射诱变获得了一株遗传稳定性好的纤溶酶高产菌株F8-C,其酶活力较出发菌株提高28.78%。采用统计学优化方法获得了组分更简单、用量更少、更利于菌株产酶的培养基:可溶性淀粉41.6g/L、黄豆粕粉26.2g/L、CaCl_2 1.0g/L,KH_2PO_42.0g/L。在此基础上,3L摇瓶放大试验结果显示,菌株F8-C的产酶量达到(3231±21)U/mL,较出发菌株H-A-3提高44.8%。结果表明利用^(60)Co辐射诱变育种,并采用统计学方法优化培养基,对于提高枯草芽孢杆菌纤溶酶的产酶量是一种有效策略。该研究结果也将为下一步发酵罐扩大试验奠定基础。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 纤溶酶 发酵培养基 发酵条件 优化
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淡紫灰链霉菌H2产α-葡萄糖苷酶抑制剂发酵条件优化 被引量：1
8
作者 朱钦豪 边亚西 +3 位作者 吴昊 梁智群 陈桂光 曾伟 《中国酿造》 CAS 北大核心 2016年第2期18-23,共6页
采用响应面的方法对淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)H2产α-葡萄糖苷酶抑制剂的发酵条件进行优化,经过单因素试验和Plackett-Burman试验设计筛选出对产α-葡萄糖苷酶抑制剂影响较为显著的3个因素:初始pH、接种量、发酵时间,利用... 采用响应面的方法对淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)H2产α-葡萄糖苷酶抑制剂的发酵条件进行优化,经过单因素试验和Plackett-Burman试验设计筛选出对产α-葡萄糖苷酶抑制剂影响较为显著的3个因素:初始pH、接种量、发酵时间,利用最陡爬坡试验确定Box-Behnken中心组合试验设计的中心点,然后进行中心组合试验对发酵条件进行优化,得出最佳发酵条件为初始pH值为6.5、发酵时间4 d、接种量9%,经过3次试验验证,该发酵液抑制率稳定在68.79%,与预测值相接近。 展开更多
关键词 Α-葡萄糖苷酶抑制剂 淡紫灰链霉菌 响应面法 降血糖作用
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曲霉菌降解机械润滑油的研究
9
作者 马义丽 冯莲 +3 位作者 周媛 赖洪敏 刘杨 李有志 《安全与环境学报》 CAS CSCD 2006年第4期9-13,共5页
分离出能高效降解机油的真菌并研究其使用方法。从机械润滑油污染的土中分离出2株真菌，GXUA和GXUB。形态鉴定为曲霉属（Aspergillus）菌。rDNA的ITS序列同源性分析表明，GXUA与A．tubingens，GXUB与A．fumigatus菌株SRRC43完全同源。... 分离出能高效降解机油的真菌并研究其使用方法。从机械润滑油污染的土中分离出2株真菌，GXUA和GXUB。形态鉴定为曲霉属（Aspergillus）菌。rDNA的ITS序列同源性分析表明，GXUA与A．tubingens，GXUB与A．fumigatus菌株SRRC43完全同源。根据均匀设计的油-矿质液中的摇床发酵结果，混合菌体对机油的降解效率高于单菌株，最佳发酵条件为25g菌丝体／L矿质液，DH：5．0，26℃。在此条件下，于10g机油／L矿质液中摇床发酵9d，其降解效率为95．90％。液-质色谱分析表明，混合菌能降解机油中700-900Dt的大分子。用两菌株的孢子和其他两种生物材料试制了实验室级的颗粒（直径1cm）生物制剂。在实验室级水平上，按500粒／m^2水面和150粒／kg土用量分别处理具有约2mm厚油膜的水（自来水和海水）和50g机油／kg土的土壤，处理后的水和土壤中残余油量符合国家有关环境污染控制标准，添加油酸钠和H2O2能够显著提高降解效率。 展开更多
关键词 应用微生物学 曲霉属 机械润滑油 降解 生物制剂
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γ-聚谷氨酸高黏发酵液中细菌总核糖核酸提取方法的比较
10
作者 唐真 王骏 +3 位作者 陈桂光 梁智群 韦宇拓 曾伟 《中国酿造》 CAS 北大核心 2016年第1期24-28,共5页
高黏度发酵液具有菌体不易分离的特点。为了从γ-聚谷氨酸高黏发酵液中提取细菌总核糖核酸,利用磷酸缓冲液稀释发酵液、离心收集、焦碳酸二乙酯水洗涤以及溶菌酶处理的四步法收集菌体并制备核糖核酸待分离样品,进而分别采用RNAiso plus... 高黏度发酵液具有菌体不易分离的特点。为了从γ-聚谷氨酸高黏发酵液中提取细菌总核糖核酸,利用磷酸缓冲液稀释发酵液、离心收集、焦碳酸二乙酯水洗涤以及溶菌酶处理的四步法收集菌体并制备核糖核酸待分离样品,进而分别采用RNAiso plus提取法,EZ-10 RNA Miniprep kit试剂盒及Pure Link RNA Mini kit试剂盒法提取总核糖核酸,并通过琼脂糖凝胶电泳、核酸浓度检测仪和反转录聚合酶链式反应比较了三种方法提取总核糖核酸的效果。结果表明,四步法获得的菌体样品可以满足后续总核糖核酸提取的要求,三种方法提取的核糖核酸均能满足一般反转录聚合酶链式反应的要求,其中Pure Link和RNAiso提取的核糖核酸A_(260nm)/A_(230nm)>2.0,纯度较好,Pure Link具有快速提取的优势而RNAiso则适用于大量样品的提取。 展开更多
关键词 高黏度发酵液 枯草芽孢杆菌 菌体分离 总核糖核酸提取 反转录聚合酶链式反应
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