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猪卵母细胞化学辅助手工去核及手工核移植胚胎发育能力因素的研究 被引量：6
1
作者 任子利 赵彦玲 +3 位作者 杨小淦 陆阳清 卢晟盛 卢克焕 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期921-931,共11页
本研究在筛选猪化学辅助手工去核最佳脱羰秋水酰碱(Demecolcine,DC)浓度的基础上,探讨了各种因素对手工重构胚发育的影响,以期建立高效的猪手工体细胞核移植技术体系。观察不同成熟时间卵母细胞在不同DC浓度下的去核效率,并进一步比较... 本研究在筛选猪化学辅助手工去核最佳脱羰秋水酰碱(Demecolcine,DC)浓度的基础上,探讨了各种因素对手工重构胚发育的影响,以期建立高效的猪手工体细胞核移植技术体系。观察不同成熟时间卵母细胞在不同DC浓度下的去核效率,并进一步比较了化学辅助手工去核法和荧光染色去核法、不同类型的供体细胞(颗粒细胞、新生巴马肌肉成纤维细胞和胎儿成纤维细胞)和供体细胞的不同处理方法(70%～80%汇合、血清饥饿法和100%接触抑制法)对重构胚发育能力的影响。结果表明:(1)利用DC诱导去核,对体外成熟培养44h的卵母细胞以浓度0.4μg.mL-1作用0.5～1h为宜。(2)用DC化学辅助手工去核与用荧光染色去核的重构胚囊胚发育率差异不显著(13.11%vs 9.25%,P>0.05)。(3)以胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞为供体构建的重构胚的融合率、卵裂率及囊胚率均差异不显著(P>0.05)。(4)用70%～80%汇合(对照组)组、接触抑制组和血清饥饿组的细胞作供体构建的重构胚,在融合率上,接触抑制组显著高于对照组(P<0.05);在分裂率与囊胚率上,各组之间均无显著差异(P>0.05)。研究结果表明,化学辅助手工去核法在实际生产中可以替代荧光染色去核法,能省去去核过程中荧光染色及紫外光照射去核等步骤,从而简化了猪手工体细胞核移植程序,提高了猪手工体细胞核移植效率,能为高效的猪手工体细胞核移植技术体系的建立提供参考。 展开更多
关键词 猪 化学辅助去核 脱羰秋水酰碱 手工体细胞核移植
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调控miR-99a表达对猪颗粒细胞增殖和凋亡的影响
2
作者 陈圆 侯晗琦 +3 位作者 任宣 薛青松 徐泰然 李湘萍 《西南大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第6期57-67,共11页
miR-99a是一种在卵巢组织中表达较高的miRNA,与颗粒细胞在卵泡闭锁过程中的凋亡有关。为了解miR-99a对猪颗粒细胞增殖和凋亡的作用,首先检测了miR-99a在不同程度闭锁的猪卵泡中的表达水平,随后通过正负调控miR-99a表达的方法探究其对猪... miR-99a是一种在卵巢组织中表达较高的miRNA,与颗粒细胞在卵泡闭锁过程中的凋亡有关。为了解miR-99a对猪颗粒细胞增殖和凋亡的作用,首先检测了miR-99a在不同程度闭锁的猪卵泡中的表达水平,随后通过正负调控miR-99a表达的方法探究其对猪颗粒细胞增殖和凋亡的影响。结果显示,与健康卵泡(HF)组相比,miR-99a的表达在早期闭锁卵泡(EF)组中显著升高(p<0.01),在晚期闭锁卵泡(PF)组无显著变化(p>0.05)。相较于对照组,miR-99a过表达组的细胞增殖水平下降,细胞凋亡水平上升,细胞周期在S期停滞,细胞周期相关基因CDK1与CDK4及促凋亡基因BAD的表达显著增加(p>0.05)。自噬相关基因ATG13的表达也显著上调(p<0.05),但凋亡相关基因BCL-2与TP53的表达变化差异并不显著(p>0.05)。与对照组相比,抑制miR-99a表达对细胞周期和凋亡无显著影响,CDK1、CDK4、BAD、ATG13、BCL-2、TP53的表达无显著变化(p>0.05)。以上结果表明,miR-99a能够有效抑制猪颗粒细胞的增殖并促进其凋亡。 展开更多
关键词 miR-99a 颗粒细胞 闭锁卵泡 增殖 凋亡
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利用双向电泳构建并优化超数排卵犊牛卵泡液蛋白质图谱 被引量：1
3
作者 赵海峰 张飒 +5 位作者 陈集成 柯浩 陈东峰 陈宝剑 陆凤花 韦英明 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第14期123-125,共3页
以2～5月龄超数排卵犊牛卵泡液为研究对象,比较不同pH值的IPG胶条和4种上样量(150、250、350、450μg)对卵泡液蛋白图谱构建的影响。结果表明,在pH 4～7的IPG胶条、上样量为350μg时,获得较好质量的卵泡液蛋白图谱,并获得约319个蛋白点... 以2～5月龄超数排卵犊牛卵泡液为研究对象,比较不同pH值的IPG胶条和4种上样量(150、250、350、450μg)对卵泡液蛋白图谱构建的影响。结果表明,在pH 4～7的IPG胶条、上样量为350μg时,获得较好质量的卵泡液蛋白图谱,并获得约319个蛋白点。成功构建的卵泡液蛋白双向电泳技术,为进一步研究犊牛与成年牛卵泡液中差异蛋白质组学分析奠定基础。 展开更多
关键词 双向电泳 蛋白质组学 犊牛 卵泡液
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瘦素对水牛卵母细胞体外成熟和体外受精胚胎发育的影响 被引量：2
4
作者 陆阳清 罗茜 +4 位作者 江明生 叶丹娜 杨小淦 许慧艳 卢克焕 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期697-700,共4页
【目的】探讨瘦素在水牛体外胚胎生产体系中的作用机理,提高体外胚胎生产效率,为利用分离精子加速水牛品种改良及良种群的扩繁奠定基础。【方法】分别在水牛卵母细胞成熟培养液和胚胎培养液中添加瘦素,研究其对水牛卵母细胞体外成熟率... 【目的】探讨瘦素在水牛体外胚胎生产体系中的作用机理,提高体外胚胎生产效率,为利用分离精子加速水牛品种改良及良种群的扩繁奠定基础。【方法】分别在水牛卵母细胞成熟培养液和胚胎培养液中添加瘦素,研究其对水牛卵母细胞体外成熟率和体外受精胚胎发育率的影响。【结果】在水牛卵母细胞体外成熟液阶段,添加瘦素不仅能促成熟,还能提高其胚胎发育潜能;在体外受精后的胚胎培养阶段,添加瘦素也能显著提高囊胚发育率,二者的最佳瘦素浓度均为10ng/mL。在最佳瘦素浓度(10ng/mL)下,常规精子体外受精后的囊胚发育率从19.7%(空白对照组)提高到27.0%,分离精子体外受精后的囊胚发育率从12.3%(空白对照组)提高到17.4%。【结论】瘦素能促进水牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育,并以添加10ng/mL瘦素的促进效果最明显。 展开更多
关键词 水牛 瘦素 卵母细胞 体外受精 胚胎发育
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犊牛卵泡液多肽信息分析 被引量：1
5
作者 赵海峰 柯浩 +8 位作者 张飒 陈东峰 陈集成 陈宝剑 沈创 韦英将 蒋钦杨 陆凤花 韦英明 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1909-1913,共5页
【目的】了解成年牛和犊牛卵泡液中多肽的信息表达差异,为完善犊牛卵泡液基础研究及犊牛卵母细胞体外培养体系奠定基础。【方法】采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对超排成年牛和超排犊牛卵泡液中的肽段进行分... 【目的】了解成年牛和犊牛卵泡液中多肽的信息表达差异,为完善犊牛卵泡液基础研究及犊牛卵母细胞体外培养体系奠定基础。【方法】采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对超排成年牛和超排犊牛卵泡液中的肽段进行分析,根据多肽的信号峰信息,通过MASCOT数据库进行蛋白检索。【结果】从成功构建的成年牛与犊牛卵泡液质谱多肽信号峰模型图谱可知,超排犊牛卵泡液多肽表达图谱中有60～80个信号峰,而超排成年牛的有30～40个信号峰;其中成年牛卵泡液有两个特有信号峰,质荷比为1218.58和1509.77 m/z,犊牛有1个特有信号峰,质荷比为953.54 m/z。利用MASCOT数据库对获得的卵泡液多肽信息进行蛋白检索,发现成年牛卵泡液中有18种蛋白,犊牛卵泡液中有11种蛋白。【结论】犊牛卵泡液中蛋白多肽信息峰数量多于成年牛,但卵泡液中总蛋白数量少于成年牛,这种差异可能是导致犊牛卵母细胞发育能力低于成年牛的重要原因之一。 展开更多
关键词 犊牛 卵泡液 超数排卵 多肽 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)
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EGCG对水牛卵母细胞体外成熟的影响 被引量：2
6
作者 李敏玲 陈富美 +5 位作者 廖碧云 潘宏 黄德伦 黄凤玲 陆阳清 张明 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期478-482,共5页
【目的】探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对水牛卵母细胞体外成熟质量与早期胚胎发育能力的影响,为优化水牛体外胚胎生产体系及提高其体外胚胎生产效率提供参考。【方法】在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG,以排出第... 【目的】探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对水牛卵母细胞体外成熟质量与早期胚胎发育能力的影响,为优化水牛体外胚胎生产体系及提高其体外胚胎生产效率提供参考。【方法】在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG,以排出第一极体为细胞核成熟标志,观察卵母细胞核成熟情况,检测MII期卵母细胞内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量,并统计经孤雌激活及体外受精后早期胚胎的发育情况。【结果】在体外成熟液中添加10~20μmol/L EGCG有利于水牛卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展,卵丘扩展指数（CEI）分别为2.49%和2.42%,卵母细胞成熟率（59.31%和50.98%）显著高于未添加EGCG的CK组（P〈0.05,下同）,MII期卵母细胞的GSH含量（3.21和3.25 pmol/枚）也显著高于CK组;添加20~30μmol/L EGCG可显著降低水牛MII期卵母细胞的ROS水平。以体外成熟培养获得的水牛MII期卵母细胞分别进行孤雌激活及体外受精,结果发现以在体外成熟液中添加10μmol/L EGCG的效果最佳,其对应的卵裂率和囊胚发育率均显著高于CK组。【结论】EGCG可用于优化水牛卵母细胞体外成熟体系,能有效提高卵母细胞的成熟率和体外发育潜力,且以水牛体外成熟液中添加10μmol/L EGCG的效果最佳。 展开更多
关键词 水牛 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 卵母细胞 体外成熟 胚胎发育
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水牛热休克蛋白70基因克隆及其表达分析 被引量：3
7
作者 汤玉燕 姚顺 +4 位作者 濮黎萍 赵秀玲 陈东荣 张鹏飞 张明 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期2599-2607,共9页
【目的】克隆水牛热休克蛋白70基因(HSP70)并进行生物信息学分析,同时明确HSP70基因在水牛成熟卵母细胞(MII期)和2-细胞期胚胎中的表达情况,为研究HSP70在水牛卵母细胞成熟及着床前早期胚胎发育中的作用机理提供理论依据。【方法】根据N... 【目的】克隆水牛热休克蛋白70基因(HSP70)并进行生物信息学分析,同时明确HSP70基因在水牛成熟卵母细胞(MII期)和2-细胞期胚胎中的表达情况,为研究HSP70在水牛卵母细胞成熟及着床前早期胚胎发育中的作用机理提供理论依据。【方法】根据NCBI已公布的水牛HSP70基因mRNA预测序列(MH814759.1)设计引物,通过RT-PCR克隆水牛HSP70基因,运用DNAStar、MEGA 7.0、TMHMM 2.0及SignalP 4.1 Server等在线软件进行生物信息学分析;同时采用细胞免疫荧光分析HSP70在水牛成熟卵母细胞及2-细胞期胚胎中的表达情况。【结果】水牛HSP70基因编码区(CDS)长度为1926 bp,共编码641个氨基酸残基。克隆获得的水牛HSP70基因序列与NCBI已公布水牛HSP70基因mRNA预测序列(MH814759.1)的相似性高达97.7%;与牛、家犬、山羊、小鼠、绵羊和大鼠的HSP70基因序列具有较高的相似性,其中与牛的相似性高达99.1%。基于HSP70基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示,水牛与牛的亲缘关系最近。水牛HSP70分子量为70.27 kD,分子式为C3088H4967N8670972S15,理论等电点(pI)为5.67,不稳定系数为32.84,属于稳定蛋白;不存在跨膜结构及信号肽,主要定位于细胞质(60.9%)、细胞核(30.4%)及线粒体(8.7%),其亲水性较强;水牛HSP70蛋白结构以α-螺旋和β-折叠为主。HSP70在水牛成熟卵母细胞及2-细胞期胚胎中均有表达,且主要集中在细胞质。【结论】水牛HSP70基因在进化过程中具有高度的保守性,在水牛成熟卵母细胞和着床前早期胚胎中均有表达,且主要集中在细胞质,属于结构型HSP70。 展开更多
关键词 水牛 热休克蛋白70(HSP70) 基因克隆 表达分析 细胞质
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血管内皮生长因子对水牛卵母细胞体外受精的影响 被引量：1
8
作者 蒋丽 潘洪丽 +4 位作者 李敏玲 廖碧云 付强 张明 卢克焕 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1919-1922,共4页
【目的】探讨血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)对水牛卵母细胞体外受精的影响,为优化水牛卵母细胞体外培养体系及提高水牛体外胚胎生产效率奠定基础。【方法】以带有3层以上卵丘细胞的卵丘—卵母细胞复合体(C... 【目的】探讨血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)对水牛卵母细胞体外受精的影响,为优化水牛卵母细胞体外培养体系及提高水牛体外胚胎生产效率奠定基础。【方法】以带有3层以上卵丘细胞的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)为材料,分别在水牛卵母细胞体外成熟液和受精液中添加重组人VEGF165,研究VEGF对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精和早期胚胎发育的影响。【结果】在成熟液中添加10 ng/mL VEGF,水牛卵母细胞的第一极体排出率由57.3%提高到72.3%,差异显著(P<0.05,下同);体外受精后的受精卵分裂率由41.0%显著提高到53.3%。在受精液中添加10 ng/mL VEGF,水牛体外受精的受精卵分裂率由41.9%提高到63.0%,差异极显著(P<0.01,下同),囊胚形成率由17.0%显著提高到32.6%。在成熟液和受精液中同时添加10 ng/mL VEGF,水牛体外受精的受精卵分裂率和囊胚形成率由43.4%和19.0%极显著提高到64.3%和27.2%,囊胚细胞数由89.5显著提高到106.8。【结论】VEGF能促进水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎的发育,因此可将VEGF用于水牛卵母细胞体外受精体系的优化,提高水牛体外胚胎生产效率。 展开更多
关键词 水牛 血管内皮生长因子(VEGF) 卵母细胞 体外受精 卵裂率 囊胚形成率
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水牛波形蛋白基因克隆及其表达分析 被引量：1
9
作者 濮黎萍 候振 +4 位作者 徐壮壮 陈富美 王焕景 黄凤玲 张明 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期2266-2272,共7页
【目的】克隆水牛波形蛋白(VIM)基因,并明确VIM基因在水牛成熟卵母细胞(MII期)和早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况,为研究VIM在卵母细胞成熟及附植前胚胎发育中的作用机理打下基础。【方法】根据GenBank上已公布的水牛VIM基因mRNA序列... 【目的】克隆水牛波形蛋白(VIM)基因,并明确VIM基因在水牛成熟卵母细胞(MII期)和早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况,为研究VIM在卵母细胞成熟及附植前胚胎发育中的作用机理打下基础。【方法】根据GenBank上已公布的水牛VIM基因mRNA序列设计引物,采用RT-PCR克隆水牛VIM基因,利用在线软件程序对克隆获得的水牛VIM基因进行生物信息学分析,同时以细胞免疫荧光试验检测VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况。【结果】水牛VIM基因长度为1469 bp,其编码区长度1401 bp,编码466个氨基酸。水牛VIM基因序列与人类、黑猩猩、食蟹猴、家犬、马和牛的VIM基因序列具有高度的同源性,分别为93%、93%、93%、94%、94%和99%;基于VIM基因序列构建的系统发育进化树也显示水牛与牛的亲缘关系最近。水牛VIM的分子量为53.73 k D,理论等电点(p I)5.05,主要在线粒体中表达,稳定性差(不稳定系数53.65),具有较强的亲水性,无跨膜结构,不属于分泌型蛋白,其蛋白结构以α-螺旋为主。VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中均有表达,且在成熟卵母细胞中的表达量明显高于早期胚胎。【结论】水牛VIM基因编码序列具有较高的保守性,且在水牛成熟卵母细胞(MII期)中的表达量明显高于早期胚胎(2-细胞阶段)。 展开更多
关键词 水牛 波形蛋白(VIM) 基因克隆 生物信息学分析 表达分析
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