携带bla_(SPM)基因的多重耐药铜绿假单胞菌分离鉴定及生物学特性研究

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作者 马玲 杨清 +5 位作者 韦珊珊 覃绍敏 许力士 韦珏 陈凤莲 林俊 《动物医学进展》 北大核心 2025年第9期1-9,共9页

旨在开展环境样品中铜绿假单胞菌的存在、耐药性、耐药基因携带、致病性及生物膜形成的研究。通过分离纯化、形态特征、生化鉴定和16S rRNA鉴定菌种,随后进行药敏试验、部分药物MIC测定、耐药基因检测、生物膜形成能力测定、毒力因子检... 旨在开展环境样品中铜绿假单胞菌的存在、耐药性、耐药基因携带、致病性及生物膜形成的研究。通过分离纯化、形态特征、生化鉴定和16S rRNA鉴定菌种,随后进行药敏试验、部分药物MIC测定、耐药基因检测、生物膜形成能力测定、毒力因子检测及细菌和胞外产物致病性试验。结果分离到1株铜绿假单胞菌,命名为PA/GX912;该菌对头孢噻呋钠和亚胺培南敏感,对美罗培南中介,对大环内酯类、氯霉素类、脂肽类、单环内酯类药物耐药,为多重耐药菌株;PCR检测发现,菌株同时携带bla_(SPM-1)、bla_(OXA-48)和bla_(GIM-1)共3种碳青霉烯酶基因以及aph(3′)-Ⅱa、SulⅠ和norA耐药基因,耐药基因检测结果与耐药表型一致;群体感应系统lasR基因检测阳性,rhlR基因阴性,生物膜形成能力强,对4周龄昆明小鼠有一定致病性,LD_(50)为2.51×10^(8)CFU/mL,胞外产物对小鼠无致病性。结果表明,从养殖场环境中分离鉴定到1株多重耐药铜绿假单胞菌,该菌携带多种耐药基因和lasR基因,具有较强的生物膜形成能力和一定的致病性。研究结果为环境中铜绿假单胞菌存在及防控提供了科学依据,也为其耐药机制和致病机理的深入研究奠定基础。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 碳青霉烯酶 多重耐药 毒力因子 生物膜

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广西规模水禽养殖场鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定与耐药性分析 被引量：4

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作者 陈晓玉 谭奕舟 +9 位作者 莫智杰 胡静 李军 李常挺 白慧丽 王乐平 马春霞 尹杨燕 彭昊 廖玉英 《江苏农业科学》 北大核心 2024年第9期213-219,共7页

为了解广西地区规模化水禽养殖场鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的流行血清型、耐药情况及遗传关系,从广西南宁、贵港等地规模化水禽养殖场中临床上疑似感染RA的病死鸭、鹅体内得到5株分离菌,对分离菌进行鉴定,检测其毒... 为了解广西地区规模化水禽养殖场鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的流行血清型、耐药情况及遗传关系,从广西南宁、贵港等地规模化水禽养殖场中临床上疑似感染RA的病死鸭、鹅体内得到5株分离菌,对分离菌进行鉴定,检测其毒力基因,通过多重PCR检测方法鉴定血清型,并对其进行耐药性分析。经试验得到鉴定结果,RA分离菌株在血琼脂培养基上呈平滑圆润、露滴样,圆形隆起的灰白色菌落;革兰氏染色呈阴性短杆菌;5株分离菌经16SrRNA鉴定均为RA,将其命名为2022NNRA01~2022NNRA05;其中,血清鉴定2022NNRA01为血清1型,其余均为血清2型。药敏试验结果显示,5株RA对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢噻呋、大观霉素、氟苯尼考、磺氨甲唑敏感,对其他抗菌药物呈不同程度的耐药。其中,对安普霉素、庆大霉素、卡那霉素氨基糖苷类药物,四环素类药物多西环素和利福霉素类药物利福平的耐药率为100%。本试验经分离鉴定成功得到5株RA,且其耐药性分析结果可为广西地区RA疾病的疫苗免疫预防选择以及药物治疗提供依据。 展开更多

关键词 鸭疫里默氏杆菌 分离鉴定 血清型 毒力因子 耐药性 广西

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猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定 被引量：1

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作者 张宁 赵平 +12 位作者 刘思雨 赵硕 陈忠伟 何颖 欧阳康 卢冰霞 蒋家霞 郭旋 林昌华 赵武 黄伟坚 秦毅斌 赵凌 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期115-125,共11页

为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后... 为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白,将其进行纯化后再免疫小鼠,制备针对PDCoV-N蛋白的mAb,并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blot、亚类的鉴定、mAb特异性的鉴定。结果,成功构建pColdⅡ-PDCoV-N重组原核表达质粒,SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达,分子质量约为38 kDa;经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得1株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株;制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10^(6)。IFA、Western blot试验表明该mAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合,亚类鉴定其亚型为IgG1,轻链为κ链。该mAb只与PDCoV反应,而与其他猪肠道病毒无交叉反应,表明本研究制备的mAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的mAb,为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。 展开更多

关键词 猪德尔塔冠状病毒 N蛋白 单克隆抗体

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广西猪流产胎儿溶血葡萄球菌的分离鉴定及其16S rDNA基因系统进化分析 被引量：2

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作者 卢冰霞 周英宁 +8 位作者 段群棚 何颖 陈忠伟 梁家幸 秦毅斌 许心婷 全琛宇 赵硕 赵武 《养猪》 2021年第1期91-94,共4页

为了查清引起母猪流产的原因,从送检流产胎儿的内脏组织中分离培养细菌,对分离菌株进行革兰氏染色镜检、药敏试验、生化试验、16S rDNA基因序列测定、同源性分析及系统进化树构建。结果表明,分离菌株为革兰氏阳性球菌,其生长特性、菌落... 为了查清引起母猪流产的原因,从送检流产胎儿的内脏组织中分离培养细菌,对分离菌株进行革兰氏染色镜检、药敏试验、生化试验、16S rDNA基因序列测定、同源性分析及系统进化树构建。结果表明,分离菌株为革兰氏阳性球菌,其生长特性、菌落特征、生化试验鉴定结果基本符合《常见细菌系统鉴定手册》中溶血葡萄球菌的生化特性;但在血琼脂培养基上并未出现溶血现象。药敏试验结果表明,分离菌株仅对新生霉素、利福平和米诺环素敏感,对青霉素类、头孢类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等药物严重耐药。分离菌株16S rDNA基因与12株不同来源的溶血葡萄球菌同源性在99.8%~99.9%之间,与溶血葡萄球菌MER TA39菌株(KT719446.1)遗传进化距离最相近。小鼠致病性试验表明,分离菌株能导致小鼠出现行动迟缓、扎堆和被毛燥乱等临床症状,并能从小鼠体内分离出相同形态特征和菌体特征的菌株。表明从猪流产胎儿体内分离到的菌株是存在多重耐药性的γ-溶血葡萄球菌。 展开更多

关键词 溶血葡萄球菌 分离鉴定 16S rDNA 同源性分析

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H9亚型禽流感病毒M1蛋白原核表达及免疫效果初步研究

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作者 李小凤 谢芝勋 +11 位作者 阮志华 李孟 李丹 张民秀 谢志勤 罗思思 韦悠 谢丽基 曾婷婷 张艳芳 黄娇玲 王盛 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期1-6,共6页

旨在原核表达H9亚型禽流感病毒(AIV)M1蛋白,初步探究其免疫效果,为研制AIV疫苗奠定基础。通过构建重组质粒pET-32a-M1,诱导表达,Western blot验证蛋白表达情况,将重组蛋白免疫接种小鼠,通过测定血清中IgG抗体效价,脾细胞培养上清多细胞... 旨在原核表达H9亚型禽流感病毒(AIV)M1蛋白,初步探究其免疫效果,为研制AIV疫苗奠定基础。通过构建重组质粒pET-32a-M1,诱导表达,Western blot验证蛋白表达情况,将重组蛋白免疫接种小鼠,通过测定血清中IgG抗体效价,脾细胞培养上清多细胞因子分泌情况评价其免疫效果。结果显示,M1重组蛋白主要以可溶性蛋白存在,Western blot结果可见特异性条带。免疫接种小鼠后,血清产生IgG抗体,抗体效价为1∶30000。小鼠脾细胞上清液IL-2、IL-4、IL-6与对照组相比较,含量显著增加(P<0.01),而抑制IL-1β、IL-5、IL-13、IL-12p70、IL-18、GM-CMF、IFN-γ、TNF-α分泌。结果表明,M1重组蛋白免疫原性良好,刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,为禽流感疫苗深入研究奠定了基础。 展开更多

关键词 禽流感 M1蛋白 原核表达 免疫效果

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嗜水气单胞菌Hcp蛋白的原核表达·多克隆抗体制备及生物信息学分析

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作者 许艺兰 许佳乐 +8 位作者 卢冰霞 陈婷婷 秦毅斌 刘思雨 全琛宇 许心婷 赵硕 陈忠伟 何颖 《安徽农业科学》 CAS 2024年第23期79-84,共6页

[目的]获得嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)Hcp蛋白的多克隆抗体(Polyclonal Antibody)及基本生物学特性。[方法]利用RT-PCR方法扩增Hcp基因,构建重组表达质粒后转化BL21感受态细胞,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thi... [目的]获得嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)Hcp蛋白的多克隆抗体(Polyclonal Antibody)及基本生物学特性。[方法]利用RT-PCR方法扩增Hcp基因,构建重组表达质粒后转化BL21感受态细胞,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thiogalactoside)诱导表达获得Hcp重组蛋白,纯化后免疫家兔,制备针对该蛋白的多克隆抗体,进行抗体的效价测定、Western blotting鉴定,利用生物信息学在线工具对其基本理化性质、保守结构域、磷酸化位点、二级与三级结构进行预测。[结果]该蛋白在IPTG终浓度为0.6 mmol/L、37℃下诱导表达6 h可获得最高表达量,蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在;Western blotting结果显示,AH的培养物上清与沉淀均能够与制备的兔抗发生特异性结合,具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1.024×10^(6)。生物信息学分析表明,嗜水气单胞菌Hcp蛋白的分子式为C_(846)H_(1304)N_(224)O_(259)S_(8),共编码172个氨基酸,相对分子质量为19013.49 u,等电点(PL)为5.24,属于稳定蛋白;二级结构中无规则卷曲占比为51.74%,延伸链占比为25.00%,α-螺旋占比为19.19%,β-转角占比为4.07%。[结论]成功制备了Hcp蛋白的多克隆抗体,为进一步研究AH的VI型分泌系统(Type VI secretion system,T6SS)提供技术支持。 展开更多

关键词 嗜水气单胞菌 Hcp基因 原核表达 多克隆抗体制备 生物信息学

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猪鼻支原体重组酶介导等温扩增快速检测方法的建立和初步应用

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作者 徐悦 段群棚 +12 位作者 赵硕 吴先华 张胜斌 马青兰 张扬祖 金宣讲 覃秀珍 冯明 卢冰霞 许心婷 全琛宇 何颖 胡庭俊 《动物医学进展》 北大核心 2025年第10期43-48,共6页

为了建立一种高效、便捷的猪鼻支原体(Mhr)的新型检测方法,基于Mhr的P 37基因设计了2对特异性引物,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种Mhr的重组酶介导等温扩增技术(RAA)检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行评估,并使用该检测... 为了建立一种高效、便捷的猪鼻支原体(Mhr)的新型检测方法,基于Mhr的P 37基因设计了2对特异性引物,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种Mhr的重组酶介导等温扩增技术(RAA)检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行评估,并使用该检测方法对64份疑似或确诊Mhr的临床样品进行初步检测应用。结果显示,建立的RAA检测方法可于24℃恒温条件下,在20 min内完成对Mhr核酸的扩增,且与Mhp、SIV、APP、HPS、PRRSV等其他猪主要呼吸道疫病病原核酸均无交叉反应,特异性好;该方法对Mhr核酸的最低检出限为1.25×10^(-4)copies/μL,灵敏度高;选择阳性质粒扩增3次,均有清晰条带,重复性好;应用该方法检测了64份疑似呼吸道疫病阳性的猪鼻拭子样本,Mhr阳性率为48.43%(31/64),与实验室已建立的Mhr及猪肺炎支原体的Taq Man双重荧光PCR方法的检测结果一致。成功建立了用于Mhr的RAA检测方法,该具有特异、敏感、反应快速、操作简便的特点,适合养殖场及基层实验室对Mhr的早期初步鉴别检测。 展开更多

关键词 猪鼻支原体 重组酶介导等温扩增 鉴别检测

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鸽源大肠杆菌的分离鉴定·耐药性及致病性分析 被引量：1

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作者 黄运福 颜国庆 +8 位作者 唐作顺 兰天艳 曾雪颜 银慧慧 赵武 姜源明 俸祥仁 刘伟 彭婷 《安徽农业科学》 2025年第8期70-75,共6页

[目的]为肉鸽养殖中大肠杆菌病的防控和临床用药提供参考。[方法]通过细菌分离鉴定、药敏试验、动物致病性试验以及耐药基因和毒力基因检测对分离菌株进行分析。[结果]分别从病死鸽肝脏组织、腹泻鸽肛拭子和死胚鸽蛋中各分离到1株大肠杆... [目的]为肉鸽养殖中大肠杆菌病的防控和临床用药提供参考。[方法]通过细菌分离鉴定、药敏试验、动物致病性试验以及耐药基因和毒力基因检测对分离菌株进行分析。[结果]分别从病死鸽肝脏组织、腹泻鸽肛拭子和死胚鸽蛋中各分离到1株大肠杆菌,分别命名为E.coli-SW、E.coli-FX、E.coli-SP;3株大肠杆菌对头孢他啶、头孢曲松、阿米卡星敏感,对其他15种药物耐药,能检测到TEM、aacC2、aacC4、qnrA、sul1、sul2、floR和tetA耐药基因;3株大肠杆菌均能致死小鼠,E.coli-SW和E.coli-FX检测到fyuA和irp2毒力基因,而E.coli-SP未检测到毒力基因。[结论]分离的3株大肠杆菌具有多重耐药性和一定的致病性,可为当地鸽源大肠杆菌病的防治和研究提供参考。 展开更多

关键词 鸽 大肠杆菌 分离鉴定 耐药性 致病性

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饲料添加中药药渣对肉鸽生长性能的影响

9

作者 蓝庆同 刘金花 +3 位作者 李晓霞 傅静 马家宝 谢志勤 《中南农业科技》 2025年第1期265-267,共3页

选取同日孵化、体重相近的14日龄健康肉鸽120只,在基础日粮中分别添加0、0.5%、1.0%、2.0%的中药(芪麦口服液)药渣,试验期14 d,探讨不同水平的中药药渣添加剂对肉鸽生长性能的影响,并评价中药药渣添加剂的效果和最佳添加量。结果表明,... 选取同日孵化、体重相近的14日龄健康肉鸽120只,在基础日粮中分别添加0、0.5%、1.0%、2.0%的中药(芪麦口服液)药渣,试验期14 d,探讨不同水平的中药药渣添加剂对肉鸽生长性能的影响,并评价中药药渣添加剂的效果和最佳添加量。结果表明,与对照相比,添加0.5%、1.0%、2.0%中药药渣处理的肉鸽平均日增重差异均不显著,但平均日采食量均显著减少,各处理间差异不显著;添加1.0%中药药渣的料重比显著降低,各处理间差异不显著;添加0.5%、1.0%、2.0%中药药渣处理的肉鸽翅羽长均显著伸长,添加1.0%中药药渣的翅羽宽增宽显著;添加0.5%、1.0%、2.0%中药药渣处理的肉鸽粗蛋白消化率均显著增强,添加2.0%中药药渣的肉鸽粗脂肪消化率显著增强,添加0.5%、1.0%中药药渣的肉鸽粗灰分消化率均显著增强。说明在基础日粮中添加1.0%中药药渣可提高肉鸽的生长性能及对营养物质的消化率,降低料重比,实现资源可持续利用、低成本健康生态养殖。 展开更多

关键词 肉鸽 饲料 中药药渣 生长性能

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一株鸡源植物乳杆菌的分离鉴定及体外抑菌特性研究 被引量：3

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作者 尹杨燕 廖玉英 +8 位作者 李军 钟舒红 李小宁 李常挺 王乐平 彭红艳 石艳 韦天超 彭昊 《广西畜牧兽医》 2021年第5期202-204,共3页

抗生素耐药性严重威胁着人类和动物的健康,为在畜禽中寻找更经济、可持续、安全的非抗生素饲料添加剂。本试验以健康雏鸡粪便为试验材料,对粪便中的细菌进行分离鉴定并以特定致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌)为指示菌,研究其体外抑菌特性。... 抗生素耐药性严重威胁着人类和动物的健康,为在畜禽中寻找更经济、可持续、安全的非抗生素饲料添加剂。本试验以健康雏鸡粪便为试验材料,对粪便中的细菌进行分离鉴定并以特定致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌)为指示菌,研究其体外抑菌特性。结果表明,试验从健康雏鸡粪便中分离鉴定出一株植物乳杆菌,编号为GX 20200417-1。分离获得的菌株再通过早期定植试验发现该菌作为先接种培养菌或与致病菌(大肠杆菌和沙门氏菌)同时接种培养时,均对致病菌都有明显的抑制作用,具有用于研制益生菌制剂的潜力。 展开更多

关键词 植物乳秆菌 分离鉴定 体外抑菌试验 益生菌

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一株仔猪源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其益生特性研究 被引量：12

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作者 卢冰霞 周英宁 +9 位作者 梁家幸 秦毅斌 陈忠伟 何颖 赵硕 蒋冬福 李斌 段群棚 刘磊 赵武 《养猪》 2020年第3期9-13,共5页

为了筛选优质猪源益生菌菌种资源,为畜禽微生态制剂的研究与开发提供优质候选菌株,试验以健康仔猪新鲜粪便为分离材料,通过高温处理分离芽孢杆菌,并对其进行形态特征、生化及分子生物学鉴定与益生特性研究。结果表明:从健康仔猪新鲜粪... 为了筛选优质猪源益生菌菌种资源,为畜禽微生态制剂的研究与开发提供优质候选菌株,试验以健康仔猪新鲜粪便为分离材料,通过高温处理分离芽孢杆菌,并对其进行形态特征、生化及分子生物学鉴定与益生特性研究。结果表明:从健康仔猪新鲜粪便中分离获得多株细菌,选取其中1株生长快速、形态特征典型的菌株进行鉴定,确定该分离菌为枯草芽孢杆菌。益生特性研究表明,该分离菌菌株具有较强的耐热、耐酸、耐胆盐等益生特性,同时具有一定的拮抗致病菌作用,对大部分抗生素敏感,对小鼠无毒副作用,可作为畜禽微生态制剂菌种的候选菌株。 展开更多

关键词 仔猪 益生菌 枯草芽孢杆菌 分离 鉴定

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不同植物来源单宁和没食子酸对常见致病菌的体外抑菌效果研究 被引量：9

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作者 刘青 彭红艳 +14 位作者 马春霞 钟舒红 李军 李常挺 白慧丽 石艳 尹杨燕 王乐平 李凤生 刘朝干 任浪涛 郭青海 董胜美 彭昊 廖玉英 《中国畜禽种业》 2022年第9期37-42,共6页

为了解不同植物来源单宁对危害水产畜牧业的主要致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌)的抑菌效果。采用体外共培养的方法,通过分析不同来源植物单宁和没食子酸对4种常见致病菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,来探... 为了解不同植物来源单宁对危害水产畜牧业的主要致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌)的抑菌效果。采用体外共培养的方法,通过分析不同来源植物单宁和没食子酸对4种常见致病菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,来探讨单宁和没食子酸对致病菌的体外抑菌作用的影响。结果显示,与水解单宁(塔拉、栗木、五倍子、橡椀)和缩合单宁(白坚木、荆树皮)相比,没食子酸对大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌具有极强的抑菌作用,但是对于金黄色葡萄球菌没有抑菌作用。其余不同植物来源的单宁对4株致病菌均有抑菌效果,对大肠杆菌抑菌效果最好,对产气荚膜梭菌抑菌效果较弱,并且抑菌效果随着单宁浓度升高而增加。塔拉单宁对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果最好,最小抑菌浓度为16mg/mL,对产气荚膜梭菌最小抑菌浓度为64mg/mL。白坚木单宁对致病菌抑菌效果最差,对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为64mg/mL,对产气荚膜梭菌最小抑菌浓度达到128mg/mL。说明不同植物来源的单宁抑菌效果存在明显差异,塔拉单宁对常见致病菌均有较好的抑菌效果,在水产畜牧业上拥有非常大的潜力和市场前景。 展开更多

关键词 单宁 塔拉 常见致病菌 体外共培养 抑菌效果

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猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用 被引量：4

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作者 周颖 赵硕 +10 位作者 覃国喜 梁龙华 肖婷 陈忠伟 卢冰霞 秦毅斌 林昌华 张胜斌 段群棚 胡庭俊 何颖 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期11-16,共6页

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感... 为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。 展开更多

关键词 猪肺炎支原体 猪鼻支原体 TaqMan荧光定量PCR

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1株牛源屎肠球菌的分离鉴定及其益生特性 被引量：5

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作者 钟舒红 彭红艳 +7 位作者 李军 石艳 白慧丽 李常挺 马春霞 吴翠兰 兰美益 彭昊 《江苏农业科学》 北大核心 2024年第2期198-204,共7页

利用形态学观察、生理生化试验与分子生物学方法对分离自牛瘤胃内容物的1株肠球菌GXNN20210320-4进行分类学鉴定,并通过生长性能测定,动物安全性试验、耐受性试验及体外抑菌试验等评价该菌的益生特性,旨在为进一步研究该菌株及开发成益... 利用形态学观察、生理生化试验与分子生物学方法对分离自牛瘤胃内容物的1株肠球菌GXNN20210320-4进行分类学鉴定,并通过生长性能测定,动物安全性试验、耐受性试验及体外抑菌试验等评价该菌的益生特性,旨在为进一步研究该菌株及开发成益生菌制剂提供一定的前期基础。结果显示,肠球菌GXNN20210320-4为屎肠球菌,该菌从4 h开始进入对数增长期并持续至14 h,生长繁殖速度较快,生长周期短,适合工业化生产。小鼠安全性试验显示,屎肠球菌GXNN20210320-4不是致病性微生物,对于动物可能是安全的。在模拟人工胃液(pH值=3.0)和模拟人工肠液(pH值=6.8)中孵育3 h后屎肠球菌GXNN20210320-4存活率分别为76.85%、80.26%,在0.3%胆盐浓度下孵育1、3 h的存活率分别为83.15%、70.74%,在0.5%胆盐浓度下孵育1、3 h的存活率分别为57.97%、46.78%,说明屎肠球菌GXNN20210320-4具有较好的耐酸耐胆盐能力,该菌株能够经受胃肠道消化液的抑制而发挥作用。屎肠球菌GXNN20210320-4在60℃水浴中孵育15 min后仍有82.35%的菌株存活率,80℃水浴中孵育15 min后活菌数为0,表明屎肠球菌GXNN20210320-4可耐受60℃高温,而不能长时间耐受80℃的高温。体外抑菌试验显示,屎肠球菌GXNN20210320-4对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制能力,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最好。综上所述,本研究中的牛源屎肠球菌GXNN20210320-4生长性能良好,对动物无致病性,具有良好的益生特性和抑菌作用,可作为益生菌株进一步开发和应用。 展开更多

关键词 屎肠球菌 分离鉴定 益生特性 抑菌作用 益生菌

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鸡圆圈病毒3型可视化LAMP检测方法的建立及应用 被引量：3

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作者 张民秀 谢芝勋 +6 位作者 张艳芳 谢志勤 谢丽基 李孟 罗思思 曾婷婷 王粲 《河南农业科学》 北大核心 2024年第4期128-136,共9页

建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方... 建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的扩增温度、引物浓度和反应时间,通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测,验证鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。结果显示,鸡GyV3 LAMP检测方法的反应体系:总体积为20.0μL,包括DNA模板1.0μL,2×Master Mix 10.0μL,内引物GyV3-FIP和GyV3-BIP混合液(工作浓度16.0μmol/L)2.0μL,外引物GyV3-F3和GyV3-B3混合液(工作浓度2.0μmol/L)2.0μL,环引物GyV3-LF和GyV3-LB混合液(工作浓度8.0μmol/L)2.0μL,ddH_(2)O 3μL;鸡GyV3 LAMP检测方法的扩增程序:66℃反应20 min,80℃灭活5 min。鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL,组内和组间变异系数小于5%;与常规PCR方法检测临床样品的结果比较,两者结果符合率达100%。建立的鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,具有特异性好、敏感性高及污染小等优点,且检测结果可通过肉眼观察进行判断,适用于GyV3的临床快速筛查。 展开更多

关键词 鸡圆圈病毒3型(GyV3) 可视化LAMP 特异性引物 诊断方法 敏感性

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同时鉴别诊断H7亚型和5种NA亚型禽流感病毒GeXP检测方法的建立

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作者 罗思思 谢芝勋 +8 位作者 李孟 李丹 谢丽基 王盛 张民秀 黄娇玲 谢志勤 曾婷婷 张艳芳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期670-677,共8页

目的旨在建立同时鉴别诊断H7亚型及其5种NA亚型(N2、N3、N4、N7和N9)AIV的检测方法。方法针对H7亚型HA基因、5种NA亚型NA基因和所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计了6对亚型特异性引物和1对AIV亚型通用检测引物,利用GeXP多基因表达... 目的旨在建立同时鉴别诊断H7亚型及其5种NA亚型(N2、N3、N4、N7和N9)AIV的检测方法。方法针对H7亚型HA基因、5种NA亚型NA基因和所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计了6对亚型特异性引物和1对AIV亚型通用检测引物,利用GeXP多基因表达和毛细管电泳分析技术,建立同时检测H7亚型和5种NA亚型AIV的GeXP高通量分型鉴别诊断方法,对其进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果特异性结果显示该法单管可同时检测H7、N2、N3、N4、N7和N9亚型AIV,均能检出对应的亚型AIV,通用检测引物检出所有亚型AIV,与其它常见禽病病原体不存在交叉反应。敏感性结果显示该法对7种AIV目的基因(含H7、N2、N3、N4、N7、N9基因)浓度均为100拷贝/μL时,仍可同时检测出。该法对150份临床样品的检测结果与病毒分离鉴定一致。结论本研究建立的同时鉴别诊断H7亚型和5种亚型AIV GeXP高通量检测方法具有特异性强、敏感性高、快速和简便等优点,为防控AIV提供新型检测方法。 展开更多

关键词 H7亚型 NA亚型 禽流感病毒 GeXP 高通量

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H9N2亚型禽流感病毒M2e蛋白在原核系统中的表达 被引量：1

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作者 张民秀 谢芝勋 +6 位作者 黄莉 谢志勤 刘加波 谢丽基 邓显文 罗思思 黄娇玲 《动物医学进展》 北大核心 2017年第4期7-12,共6页

以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板,经PCR扩增得到M2e基因;利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系,构建顺次连接的多拷贝体M2e,并连接入原核表达载体pGEX-6p-1,构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组... 以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板,经PCR扩增得到M2e基因;利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系,构建顺次连接的多拷贝体M2e,并连接入原核表达载体pGEX-6p-1,构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组质粒,并转化至表达宿主菌中;将测序正确的菌液经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,对蛋白进行可溶性分析;利用Western blot分析5种重组蛋白的反应原性。结果显示,在37℃下,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.25、0.25、0.5、0.25、0.75mmol/L的IPTG诱导4h时,表达量最高;2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白大小分别为31.7、37.2、42.7、48.2、53.9ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,5种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blot分析显示,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2epGEX重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体具有良好的特异性反应,为后期进一步获得高免疫原性蛋白和筛选具有通用免疫原性的重组蛋白奠定基础。 展开更多

关键词 H9N2亚型禽流感病毒 M2蛋白胞外区(M2e)蛋白 重组蛋白

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H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立 被引量：2

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作者 何莹 谢芝勋 +8 位作者 罗思思 李孟 谢志勤 谢丽基 黄莉 邓显文 黄娇玲 张艳芳 曾婷婷 《动物医学进展》 北大核心 2017年第3期1-4,共4页

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该... 为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H5亚型 N6亚型 二重逆转录-聚合酶链反应

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禽呼肠病毒在鸡胚成纤维细胞系中的增殖规律 被引量：3

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作者 沈文康 谢芝勋 +10 位作者 王盛 黄莉 谢丽基 黄娇玲 曾婷婷 张艳芳 张民秀 罗思思 范晴 谢志勤 邓显文 《动物医学进展》 北大核心 2018年第1期30-33,共4页

为研究禽呼肠病毒(ARV)在鸡胚成纤维细胞(DF1)上的增殖规律,将ARV S1133株接种至DF1细胞,连续传代3次后观察细胞病变(CPE),RT-PCR检测病毒核酸。结果显示,ARV S1133株对DF1细胞有很好的亲嗜性,并出现典型的CPE。按照Reed-Meunch方法测量... 为研究禽呼肠病毒(ARV)在鸡胚成纤维细胞(DF1)上的增殖规律,将ARV S1133株接种至DF1细胞,连续传代3次后观察细胞病变(CPE),RT-PCR检测病毒核酸。结果显示,ARV S1133株对DF1细胞有很好的亲嗜性,并出现典型的CPE。按照Reed-Meunch方法测量7个时间点的TCID50,并绘制生长曲线。结果显示,ARV感染DF1细胞后的0h^12h为静止期,12h^48h为快速增长期,并在48h达到最大的病毒效价,TCID_(50)为10^(-8.9)/0.1mL,为进一步研究ARV的致病机理,以及在DF1上研制禽呼肠病毒细胞灭活苗提供参考。 展开更多

关键词 禽呼肠病毒 鸡胚成纤维细胞 病毒效价 一步生长曲线

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鸡滑液囊支原体和禽呼肠病毒的实时荧光定量PCR快速检测 被引量：12

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作者 黄莉 谢芝勋 +6 位作者 王盛 邓显文 谢志勤 谢丽基 曾婷婷 黄娇玲 张艳芳 《动物医学进展》 北大核心 2018年第2期1-6,共6页

根据禽呼肠病毒σC和鸡滑液囊支原体vlhA基因的保守序列,分别设计了特异性引物和不同荧光基团标记的TaqMan探针,优化反应条件,建立能同时鉴别诊断鸡滑液囊支原体和禽呼肠病毒(ARV)的检测方法。结果表明,该方法能够特异地鉴别检测ARV和MS... 根据禽呼肠病毒σC和鸡滑液囊支原体vlhA基因的保守序列,分别设计了特异性引物和不同荧光基团标记的TaqMan探针,优化反应条件,建立能同时鉴别诊断鸡滑液囊支原体和禽呼肠病毒(ARV)的检测方法。结果表明,该方法能够特异地鉴别检测ARV和MS,与其他病原体无交叉反应,检测敏感性均可达到2×10拷贝数。此外,该方法抗干扰能力强,具有良好而稳定的准确性,临床样品检出率与传统检测方法相符。因此,该基于TaqMan探针建立的荧光定量PCR具有特异、灵敏、准确、实时、重复性好等优点,不仅可用于鸡群中这两种病原体的鉴别检测和疫病监测,也有利于这两种病原体感染的有效防控。 展开更多

关键词 荧光定量PCR TAQMAN 鸡滑液囊支原体 禽呼肠病毒

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