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香蕉果实MaNPC1基因原核表达及多克隆抗体制备
被引量：
2
1
作者
帅良
殷菲胧
+6 位作者
廖玲燕
刘云芬
段振华
李丽
何雪梅
李昌宝
孙健
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第7期1753-1761,共9页
【目的】对香蕉果实非特异性磷脂酶C基因(MaNPC1)开放阅读框(ORF)进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为深入探究MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。【方法】克隆MaNPC1基因ORF序列,对其进行生物信息学分析及抗原性预...
【目的】对香蕉果实非特异性磷脂酶C基因(MaNPC1)开放阅读框(ORF)进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为深入探究MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。【方法】克隆MaNPC1基因ORF序列,对其进行生物信息学分析及抗原性预测,并通过双酶切法构建其原核表达载体,利用热激法转入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,重组蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫新西兰兔,以制备多克隆抗体。同时,运用Westernblotting和实时荧光定量PCR分别检测香蕉果实贮藏过程中在炭疽病侵染胁迫下MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量。【结果】重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1经双酶切后得到1650 bp的特异性条带,说明原核表达载体构建成功,将其转入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)感受态细胞后成功表达。MaNPC1蛋白分子式为C_(2747)H_(4249)N_(769)O_(793)S_(10),分子量为61.06 kD,理论等电点(pI)为8.96;丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸含量较高,分别占氨基酸总数的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%;不稳定指数为47.14,表明其为不稳定蛋白;蛋白抗原区段丰富且亲水性氨基酸数目明显高于疏水性氨基酸,有利于后续抗体的制备。制备的多克隆抗体效价较高,为1∶2048000。Westernblotting检测发现,香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平呈上升-下降-上升的变化趋势;炭疽病侵染组MaNPC1蛋白除贮藏15 d时的表达水平比对照组低外,其他贮藏时间均略高于对照组。实时荧光定量PCR检测结果表明,MaNPC1基因相对表达量在香蕉果实贮藏过程中呈逐渐上升趋势;贮藏3~15 d,炭疽病侵染组MaNPC1基因相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)。【结论】炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平,故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。
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关键词
香蕉
MaNPC1基因
原核表达
多克隆抗体
炭疽病
贮藏
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职称材料
题名
香蕉果实MaNPC1基因原核表达及多克隆抗体制备
被引量：
2
1
作者
帅良
殷菲胧
廖玲燕
刘云芬
段振华
李丽
何雪梅
李昌宝
孙健
机构
贺州
学院
食品与
生物
工程
学院
/食品
科学
与工程
技术
研究
院
广西农业科学院农产品加工研究所/广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室/广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室培育基地
出处
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第7期1753-1761,共9页
基金
国家自然科学基金项目(31660589)
广西自然科学基金项目(2018GXNSFBA281118,2019GXNSFAA185027)
广西中青年高校教师能力提升项目(2020KY18020)。
文摘
【目的】对香蕉果实非特异性磷脂酶C基因(MaNPC1)开放阅读框(ORF)进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为深入探究MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。【方法】克隆MaNPC1基因ORF序列,对其进行生物信息学分析及抗原性预测,并通过双酶切法构建其原核表达载体,利用热激法转入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,重组蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫新西兰兔,以制备多克隆抗体。同时,运用Westernblotting和实时荧光定量PCR分别检测香蕉果实贮藏过程中在炭疽病侵染胁迫下MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量。【结果】重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1经双酶切后得到1650 bp的特异性条带,说明原核表达载体构建成功,将其转入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)感受态细胞后成功表达。MaNPC1蛋白分子式为C_(2747)H_(4249)N_(769)O_(793)S_(10),分子量为61.06 kD,理论等电点(pI)为8.96;丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸含量较高,分别占氨基酸总数的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%;不稳定指数为47.14,表明其为不稳定蛋白;蛋白抗原区段丰富且亲水性氨基酸数目明显高于疏水性氨基酸,有利于后续抗体的制备。制备的多克隆抗体效价较高,为1∶2048000。Westernblotting检测发现,香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平呈上升-下降-上升的变化趋势;炭疽病侵染组MaNPC1蛋白除贮藏15 d时的表达水平比对照组低外,其他贮藏时间均略高于对照组。实时荧光定量PCR检测结果表明,MaNPC1基因相对表达量在香蕉果实贮藏过程中呈逐渐上升趋势;贮藏3~15 d,炭疽病侵染组MaNPC1基因相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)。【结论】炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平,故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。
关键词
香蕉
MaNPC1基因
原核表达
多克隆抗体
炭疽病
贮藏
Keywords
banana
MaNPC1 gene
prokaryotic expression
polyclonal antibodies
anthracnose
storage
分类号
S668.103.6 [农业科学—果树学]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
香蕉果实MaNPC1基因原核表达及多克隆抗体制备
帅良
殷菲胧
廖玲燕
刘云芬
段振华
李丽
何雪梅
李昌宝
孙健
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
2
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