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狂犬病病毒突变株rRC-HL(GX074P1M1)的构建及其生物学特性 被引量：1
1
作者 李文芳 彭璟 +4 位作者 罗茜 杨文豪 韦显凯 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期3106-3116,共11页
【目的】构建狂犬病病毒(RABV)突变株r RC-HL(GX074P1M1)并探究其生物学特性,分析磷蛋白(P)与基质蛋白(M)部分区域联合突变对RABV转录和复制水平的影响,以了解RABV的致病机制,为靶点预防与治疗提供理论依据。【方法】通过反向遗传学技术... 【目的】构建狂犬病病毒(RABV)突变株r RC-HL(GX074P1M1)并探究其生物学特性,分析磷蛋白(P)与基质蛋白(M)部分区域联合突变对RABV转录和复制水平的影响,以了解RABV的致病机制,为靶点预防与治疗提供理论依据。【方法】通过反向遗传学技术,将RABV街毒株GX074的P蛋白P1区域(第48~78位氨基酸)与M蛋白M1区域(第1~22位氨基酸)联合嵌入弱毒株RC-HL相应位置,通过间接免疫荧光试验(IFA)、实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定突变毒株和对照毒株[RC-HL、GX074、r RC-HL(GX074PM)和CVS-11]感染细胞BSR/T7-9后的病毒滴度与核蛋白(N)基因、P基因和M基因及其蛋白相对表达量。【结果】通过病毒拯救成功获得突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)。病毒多步生长曲线测定结果显示,感染BSR/T7-9细胞24~96 h内,突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)的病毒滴度均高于亲本毒株RC-HL和GX074。通过实时荧光定量PCR检测发现,突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)在感染24和48 h时,N基因、P基因和M基因的相对表达量均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)高于亲本毒株RC-HL和GX074。Western blotting检测结果显示,在感染24 h时,与亲本毒株RC-HL相比,突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量均小幅上升;在感染48 h时,突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量均极显著高于亲本毒株RC-HL与GX074。【结论】RABV街毒株GX074的P1和M1区域联合嵌入弱毒株RC-HL获得的突变毒株r RC-HL(GX074P1M1)复制及转录水平比亲本毒株高,在细胞内具有更强的增殖能力,表明街毒株GX074的P蛋白P1区域和M蛋白M1区域在促进病毒转录及复制中发挥协同作用。 展开更多
关键词 狂犬病病毒(RABV) GX074 RC-HL P1 M1 生长特性 反向遗传
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禽传染性支气管炎病毒nsp4蛋白多克隆抗体制备及其生物学功能研究
2
作者 卢彦澎 林丽婷 +6 位作者 任丽娜 晋英浩 张桃妮 张愉 韦兰萍 吕迪 磨美兰 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期2423-2435,共13页
【目的】筛选出禽传染性支气管炎病毒(IBV)非结构蛋白4(nsp4)抗原性较好的氨基酸区域并制备多克隆抗体,为进一步研究nsp4蛋白在IBV复制过程中的功能提供物质基础,也为研发IBV新型诊断试剂盒与疫苗打下基础。【方法】对IBV Beaudette株n... 【目的】筛选出禽传染性支气管炎病毒(IBV)非结构蛋白4(nsp4)抗原性较好的氨基酸区域并制备多克隆抗体,为进一步研究nsp4蛋白在IBV复制过程中的功能提供物质基础,也为研发IBV新型诊断试剂盒与疫苗打下基础。【方法】对IBV Beaudette株nsp4蛋白进行原核表达,以融合蛋白nsp4作为免疫原免疫健康日本大耳白兔和健康阴性鸡,制备相应的兔多克隆抗体和鸡多克隆抗体,并通过间接ELISA检测、Western blotting检测及IFA验证等对制备获得的多克隆抗体进行生物学功能研究。【结果】选取nsp4蛋白第408~514位氨基酸作为原核表达序列,成功构建了nsp4蛋白原核表达载体pCZN-1-HIS-nsp4和nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA。原核表达的融合蛋白nsp4为13.6 kD,与预期结果相符,能与IBV GX-YL5株和M41株全病毒阳性血清反应。制备的兔、鸡多克隆抗体血清效价分别为1∶128000和1∶6400,均能与融合蛋白nsp4和IBV全病毒反应,且与IBV GX-YL5株、Beaudette株和M41株感染鸡胚肾细胞(CEK)表达的nsp4蛋白反应,还能与转染状态及感染IBV Beaudette株的非洲绿猴肾细胞(Vero)表达nsp4蛋白反应。实时荧光定量PCR检测结果表明,经nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA转染后,Vero细胞的病毒载量呈逐渐上升趋势,即体外过表达nsp4蛋白能促进IBV的复制。【结论】制备获得的2种IBV nsp4多克隆抗体效价高、反应性良好、特异性强,可作为细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析nsp4蛋白在IBV增殖过程中的作用机制,也为其他冠状病毒nsp4蛋白的研究提供参考。 展开更多
关键词 禽传染性支气管炎病毒(IBV) nsp4蛋白 多克隆抗体 反应性 特异性
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狂犬病病毒毒力及感染途径对小鼠致病性的影响
3
作者 杨文豪 朱敏 +3 位作者 罗茜 李霜 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 北大核心 2025年第3期973-982,共10页
[目的]探究脑内感染和肌肉感染2种途径下狂犬病病毒(RABV)感染小鼠的临床症状差异及相关细胞因子表达情况,明确其嗜神经性的作用机制,为狂犬病的科学防控及治疗提供理论依据。[方法]以RABV的弱毒株rRC-HL、标准强毒株CVS-24及街毒株GX0... [目的]探究脑内感染和肌肉感染2种途径下狂犬病病毒(RABV)感染小鼠的临床症状差异及相关细胞因子表达情况,明确其嗜神经性的作用机制,为狂犬病的科学防控及治疗提供理论依据。[方法]以RABV的弱毒株rRC-HL、标准强毒株CVS-24及街毒株GX074,分别通过肌肉注射和脑内注射2种途径感染昆明小鼠,同时设DMEM组(注射等体积的DMEM)和Blank组(不进行任何处理)。观察脑内感染和肌肉感染RABV后小鼠的发病情况及临床症状,采集濒死期小鼠脑组织样品,通过Western blotting检测小鼠脑组织中病毒蛋白的表达情况,并以实时荧光定量PCR检测小鼠脑组织中病毒基因及相关细胞因子基因的表达变化。[结果]rRC-HL株经脑内感染可使小鼠出现轻微的临床症状,但在感染7 d后小鼠临床症状逐渐消失,体重逐渐恢复,未出现死亡现象;经肌肉感染并未引起小鼠出现神经性临床症状。CVS-24株和GX074株无论是脑内感染还是肌肉感染,均可引起小鼠发病,致死率为100%,但2种感染途径引起的临床症状和死亡时间不同。肌肉感染途径下的小鼠发病时间、死亡时间均晚于脑内感染途径,症状初期表现为单侧后肢运动不协调,后期发展为双侧后肢瘫痪;脑内感染途径下,CVS-24株感染小鼠呈麻痹型,而GX074株感染小鼠为狂躁型。rRC-HL株经脑内感染可引起小鼠脑组织中IL-1β、IL-12、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、STAT1及RIG-1等细胞因子基因上调表达,但经肌肉感染时细胞因子基因的表达变化不明显;CVS-24株和GX074株的2种感染途径均可引起IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、STAT1及RIG-1等细胞因子基因上调表达。[结论]病毒毒力和感染途径同步影响RABV对小鼠的致病性,且宿主脑组织的细胞因子水平差异是RABV感染宿主后出现临床症状差异的主要原因。 展开更多
关键词 狂犬病病毒(RABV) 毒力 感染途径 致病性 细胞因子
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猪瘟病毒E^(rns)蛋白原核表达及其多克隆抗体制备
4
作者 宋丹丹 金奕欣 +5 位作者 黄袁慧 王文锋 闵开骏 张传亮 罗廷荣 李晓宁 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期2835-2842,共8页
【目的】制备猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)E^(rns)蛋白多克隆抗体,为进一步研究E^(rns)蛋白结构和功能及解析CSFV的致病机理提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法预测E^(rns)蛋白结构。以真核表达载体pCMV-HA-E^(r... 【目的】制备猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)E^(rns)蛋白多克隆抗体,为进一步研究E^(rns)蛋白结构和功能及解析CSFV的致病机理提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法预测E^(rns)蛋白结构。以真核表达载体pCMV-HA-E^(rns)为模板,PCR克隆CSFV E^(rns)基因,构建原核表达载体pET-32a-E^(rns)。将pET-32a-E^(rns)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,添加IPTG诱导E^(rns)蛋白表达,确定Erns蛋白表达形式。利用Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,以获得高纯度的E^(rns)蛋白。采用背部皮下多点注射法免疫小鼠,经4次免疫后采集小鼠血液,分离血清制备获得Erns蛋白多克隆抗体,并检测其效价和特异性。【结果】E^(rns)蛋白不含信号肽和跨膜结构域,为亲水性蛋白,含有多个B细胞抗原表位;E^(rns)基因片段大小为681 bp,其重组蛋白主要以包涵体形式表达;E^(rns)蛋白多克隆抗体对原核表达的重组蛋白效价为1∶64000,对真核表达的重组蛋白效价为1∶1000,且能特异性识别CSFV。【结论】制备获得的E^(rns)蛋白多克隆抗体具有效价高和特异性强等特点,可用于ELISA和Western blotting检测细胞中E^(rns)蛋白水平。E^(rns)蛋白多克隆抗体的制备有助于更好地理解E^(rns)蛋白在CSFV感染和免疫过程中的作用,对深入研究E^(rns)蛋白功能、CSFV生物学特性及猪瘟的防治和诊断方法的开发具有重要意义。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E^(rns)蛋白 原核表达 多克隆抗体
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罗非鱼IgT重链单克隆抗体的制备
5
作者 陈林 孙彤彤 吴文德 《南方农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期3770-3778,共9页
【目的】制备具有活性的罗非鱼IgT重链单克隆抗体,为研究罗非鱼黏膜免疫应答提供基础材料。【方法】取无乳链球菌感染的吉富罗非鱼脾脏组织,提取总RNA。采用PCR扩增罗非鱼IgT重链恒定区CH2基因片段,构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(D... 【目的】制备具有活性的罗非鱼IgT重链单克隆抗体,为研究罗非鱼黏膜免疫应答提供基础材料。【方法】取无乳链球菌感染的吉富罗非鱼脾脏组织,提取总RNA。采用PCR扩增罗非鱼IgT重链恒定区CH2基因片段,构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白并用Ni-Agarose Resin进行纯化。以重组蛋白免疫6~8周龄BALB/c小鼠,经4次免疫后,取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合。利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞株,并通过间接ELISA与Western blotting检测对单克隆抗体亚型、效价和特异性进行鉴定。【结果】扩增获得长度约546 bp的IgT重链恒定区CH2基因片段,成功构建原核表达载体pET-32a(+)-IgT,在终浓度为1 mmol/L IPTG诱导下,获得分子量约38.3 kD的重组蛋白,以包涵体形式表达。以纯化的重组蛋白免疫小鼠,经测定血清抗体效价为1∶1280000以上,满足细胞融合要求。筛选获得4株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株,其中2B11保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏号:C2023390),单克隆抗体亚型鉴定结果表明,2B11重链为IgG2b型,制备的小鼠腹水抗体纯化前效价为1∶16000,纯化后效价为1∶8000。Western blotting检测结果表明,制备的单克隆抗体能特异性识别罗非鱼皮肤黏液中大小约42 kD的天然IgT。【结论】成功制备了具有活性的抗罗非鱼IgT单克隆抗体,可用于检测罗非鱼经病原微生物感染或疫苗接种后产生的抗体。 展开更多
关键词 罗非鱼 IGT 原核表达 单克隆抗体
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猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1
6
作者 刘思雨 何颖 +6 位作者 卢冰霞 赵武 赵硕 许心婷 全琛宇 秦毅斌 欧阳康 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1238-1248,共11页
【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDC... 【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 NSP14蛋白 原核表达 多克隆抗体制备 间接ELISA
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正交设计优化蟾酥注射液的提取工艺 被引量：1
7
作者 刘城志 吴莉芩 +5 位作者 彭健波 程楸琪 吴春璇 卢嘉烨 梁正敏 何家康 《现代畜牧兽医》 2024年第2期23-27,共5页
试验旨在优化蟾酥注射液的提取工艺,试验以吲哚类总生物碱(以5-羟色胺盐酸盐计)的含量为考察指标,以加水倍数(A)、加热温度(B)和提取时间(C)为考察因素,通过L_(9)(3^(4))正交试验优化蟾酥注射液的提取工艺,确定提取工艺参数,并采用最大... 试验旨在优化蟾酥注射液的提取工艺,试验以吲哚类总生物碱(以5-羟色胺盐酸盐计)的含量为考察指标,以加水倍数(A)、加热温度(B)和提取时间(C)为考察因素,通过L_(9)(3^(4))正交试验优化蟾酥注射液的提取工艺,确定提取工艺参数,并采用最大极差法对正交试验数据分析处理。结果显示,加水倍数是影响蟾酥注射液主要成分含量的主要因素,蟾酥注射液的最佳提取工艺为10倍加水量浸泡,加热煮沸(100℃),提取时间4 h。验证性试验按最优工艺制备3批样品,采用紫外可见分光光度(UV)法测定蟾酥注射液中吲哚类总生物碱的含量为9.92 mg/L。研究表明,该提取工艺稳定可靠,可用于中试生产。 展开更多
关键词 蟾酥注射液 提取工艺 正交试验 UV法 5-羟色胺盐酸盐
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鼠源ATP5B基因克隆及其原核和真核表达载体构建
8
作者 段辰星 黄袁慧 +2 位作者 闵开骏 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1807-1816,共10页
【目的】克隆鼠源ATP5B基因,构建其原核和真核表达载体,为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】克隆鼠源ATP5B基因编码区(CDS),运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析... 【目的】克隆鼠源ATP5B基因,构建其原核和真核表达载体,为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】克隆鼠源ATP5B基因编码区(CDS),运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析。采用同源重组方法构建原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag。以原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,分析最适诱导温度和IPTG浓度。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测ATP5B蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】鼠源ATP5B基因CDS长1590 bp,鼠源ATP5B蛋白由529个氨基酸残基构成,分子量为55 kD,理论等电点(pI)为5.21,属于稳定的疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,不属于分泌蛋白;鼠源ATP5B蛋白二级结构中α-螺旋占43.67%,无规则卷曲占32.51%,β-转角占9.45%,延伸链占14.37%。原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag经IPTG诱导后,通过考马斯亮蓝染色和Western blotting在81 kD处成功检测到融合蛋白,且主要以包涵体形式表达,诱导条件以30℃、0.5 mmol/L IPTG的效果更好。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞后,在55 kD处检测到Flag标签特异性条带,即ATP5B蛋白在HEK-293T细胞中成功表达,IFA检测结果表明该蛋白主要定位在细胞质中。【结论】成功构建鼠源ATP5B基因原核和真核表达载体,原核表达载体表达出的融合蛋白主要以包涵体形式存在,只有少量可溶蛋白,真核表达的ATP5B蛋白主要定位在细胞质中。鼠源ATP5B蛋白是理化性质稳定的疏水性蛋白,无信号肽位点,不属于分泌蛋白。 展开更多
关键词 鼠源ATP5B基因 基因克隆 生物信息学分析 表达载体构建
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干扰STAT1基因表达对狂犬病病毒感染的影响
9
作者 栗朵朵 蔡宗伶 +2 位作者 张宏燕 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期3718-3727,共10页
【目的】探讨信号转导和转录激活因子1(STAT1)在狂犬病病毒(RABV)感染过程中的作用机制,为后续STAT1功能研究提供理论依据。【方法】以RABV感染小鼠小脑星形胶质细胞(C8-D1A),于接毒后12、24和48 h分别采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印... 【目的】探讨信号转导和转录激活因子1(STAT1)在狂犬病病毒(RABV)感染过程中的作用机制,为后续STAT1功能研究提供理论依据。【方法】以RABV感染小鼠小脑星形胶质细胞(C8-D1A),于接毒后12、24和48 h分别采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹(Western blotting)检测病毒基因及宿主细胞STAT1和细胞因子的表达变化;针对STAT1基因靶序列设计合成不同的siRNA序列,通过脂质体法瞬时转染C8-D1A细胞,筛选出干扰效率较高的STAT1-siRNA序列;然后以筛选出的STAT1-siRNA序列转染C8-D1A细胞,转染24 h后接种0.1 MOI的RABV,分别从转录水平和蛋白水平检测干扰STAT1基因表达对RABV复制及细胞因子表达的影响。【结果】RABV感染C8-D1A细胞后能引起STAT1蛋白的表达大幅度上升;无论是弱毒株rRC-HL还是标准强毒株CVS-11感染,都能引起C8-D1A细胞内IFN-α、IFN-β、TNF-α和IL-6等细胞因子基因上调表达。经STAT1-siRNA干扰效果验证,发现在最高浓度200 nmol/L下作用24 h后,STAT1-1616的干扰效率为81%、STAT1-2271的干扰效率为82%,干扰效果达极显著水平(P<0.01);作用48 h后,STAT1-1616的干扰效率为83%,STAT1-2271的干扰效率为75%,干扰效果达显著水平(P<0.05),故选择这2对STAT1-siRNA进行后续试验。干扰STAT1基因表达后,无论是接种弱毒株rRC-HL还是接种标准强毒株CVS-11,其N和P基因的表达均呈上调趋势,病毒N、P蛋白在接毒后24和36 h均呈上调表达趋势,说明干扰STAT1基因表达有利于上调病毒蛋白合成,而促进RABV复制;但干扰STAT1基因表达对RABV感染引起宿主细胞产生IFN-α、IFN-β、TNF-α和IL-6等细胞因子无显著影响(P>0.05)。【结论】合成的2对STAT1-siRNA序列(STAT1-1616和STAT1-2271)对C8-D1A细胞的STAT1基因有显著干扰效果。干扰STAT1基因表达有利于上调病毒蛋白合成,而促进RABV复制。 展开更多
关键词 狂犬病病毒(RABV) 信号转导和转录激活因子1基因(STAT1) RNA干扰 干扰效率 细胞因子
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鼠源eIF4A1基因克隆及其原核/真核表达鉴定 被引量：3
10
作者 李梦茹 张文 +6 位作者 段辰星 马良 栗朵朵 彭璟 梁晶晶 罗廷荣 李晓宁 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期3073-3082,共10页
【目的】克隆昆明小鼠真核生物翻译起始因子4A1基因(eIF4A1)并构建其原核/真核表达载体,探究其结构和生物学特性,为在体内外鉴定eIF4A1互作蛋白网络打下基础。【方法】以昆明小鼠脑组织总RNA反转录合成的cDNA为模板,PCR扩增鼠源eIF4A1... 【目的】克隆昆明小鼠真核生物翻译起始因子4A1基因(eIF4A1)并构建其原核/真核表达载体,探究其结构和生物学特性,为在体内外鉴定eIF4A1互作蛋白网络打下基础。【方法】以昆明小鼠脑组织总RNA反转录合成的cDNA为模板,PCR扩增鼠源eIF4A1基因编码区(CDS)序列,然后克隆到pGEX-4T-1和pcDNA3.0载体上分别构建原核/真核表达载体;利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞对原核表达载体进行诱导表达、纯化及鉴定;同时以真核表达载体转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测eIF4A1蛋白在HEK-293T细胞内的表达及分布情况;并以ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件对鼠源eIF4A1蛋白进行生物学信息分析。【结果】鼠源eIF4A1基因CDS序列长1221 bp,克隆到pGEX-4T-1载体能成功构建原核表达载体pGEX-4T-eIF4A1-Flag,在25和30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导均能大量表达出融合蛋白eIF4A1-Flag,且主要以包涵体形式存在。将鼠源eIF4A1基因克隆至pcDNA3.0载体成功构建获得真核表达载体pcDNA3.0-eIF4A1-Flag,以其转染HEK-293T细胞后,eIF4A1蛋白在HEK-293T细胞中成功表达,且主要分布在细胞质中。生物信息学分析结果表明,eIF4A1蛋白相对分子量为46.15408 kD,理论等电点(pI)为5.267,含有407个氨基酸残基;属于不稳定的亲水性非分泌蛋白,无跨膜结构,也没有信号肽,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。鼠源eIF4A1蛋白的主要互作蛋白有10个,除eIFs家族蛋白外,还包括Paip1和Pdcd4互作蛋白。【结论】eIF4A1主要是分布在细胞质,为不稳定的亲水性非分泌蛋白,无跨膜结构和信号肽,通过构建原核/真核表达载体表达获得的融合蛋白eIF4A1-Flag可用于筛选和鉴定eIF4A1互作蛋白,为深入探究eIFs的结构及生物学功能提供技术支持。 展开更多
关键词 鼠源 真核生物翻译起始因子(eIFs) eIF4A1基因 原核表达 真核表达 生物信息学分析
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