PRDM5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染Neuro-2a细胞的建立

1

作者 吴钊淳 李友 +2 位作者 何嘉文 廖科棋 李胜男 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第1期1-8,共8页

目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列... 目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列,将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-PRDM5过表达重组质粒,采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中,转染48 h后离心收集慢病毒,分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒,采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组,分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后使用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选,通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平;Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果:PCR法,GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp,GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致;GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL^(-1)。荧光显微镜,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好,且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法,与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量为75000附近出现特异性条带;与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论:成功构建PRDM5过表达慢病毒载体,建立了稳定转染的GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞。 展开更多

关键词 PR锌指区域蛋白 过表达慢病毒载体 稳定表达 Neuro-2a细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

益智醒脑方联合西医治疗对阿尔茨海默病患者脑脊液炎性因子及神经递质的影响 被引量：14

2

作者 赵姝 李克深(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期699-702,共4页

目的:探讨益智醒脑方联合西医治疗对阿尔茨海默病患者脑脊液炎性因子及神经递质的影响。方法:选择2014年10月~2016年10月收治的阿尔茨海默病患者124例为研究对象,采用随机数字表法分为观察组和对照组各62例。对照组给予多奈派齐片等西... 目的:探讨益智醒脑方联合西医治疗对阿尔茨海默病患者脑脊液炎性因子及神经递质的影响。方法:选择2014年10月~2016年10月收治的阿尔茨海默病患者124例为研究对象,采用随机数字表法分为观察组和对照组各62例。对照组给予多奈派齐片等西医常规治疗,观察组给予益智醒脑方联合西医治疗。治疗12周后,比较两组脑脊液炎性因子、神经递质、临床疗效等指标。结果:观察组有效率80.65%明显高于对照组64.52%(χ~2=4.052 9,P<0.05);脑脊液TNF-α、IL-6明显低于对照组,IL-4、IL-10含量明显高于对照组(t=10.911、8.739、5.000、4.046,P<0.05、P<0.01);多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)含量明显高于对照组(t=9.435、7.916、5.985,P<0.05、P<0.01)。结论:益智醒脑方联合西医治疗有助于缓解阿尔茨海默病临床症状,提高治疗效果,可能与抑制患者炎症症状、调节神经递质表达水平有关。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 益智醒脑方 炎性因子 神经递质

在线阅读 下载PDF 职称材料

长链非编码RNA调控神经退行性疾病的研究进展 被引量：4

3

作者 李文 赵斌 +6 位作者 郑春燕 张振华 马一明 赵江浩 李树朋 陈浩 冯杜 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 2017年第1期100-102,共3页

长链非编码RNA（lncRNA）是一种新的调控基因表达的非编码RNA。它本身不编码蛋白质,其长度在200-100 000nt之间[1]。与其他的非编码RNA相比,lncRNA的特点表现为：类型多、作用模式多和数量多。lncRNA的功能特性在某种程度上取决于它在... 长链非编码RNA（lncRNA）是一种新的调控基因表达的非编码RNA。它本身不编码蛋白质,其长度在200-100 000nt之间[1]。与其他的非编码RNA相比,lncRNA的特点表现为：类型多、作用模式多和数量多。lncRNA的功能特性在某种程度上取决于它在染色体上的位置。 展开更多

关键词 神经变性疾病 阿尔茨海默病 帕金森病 肌萎缩侧索硬化 基因表达调控 微RNAS

在线阅读 下载PDF 职称材料

APOE多态性在炎症因子诱导的神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用 被引量：1

4

作者 王岩 李晓慧 +2 位作者 季瑶 崔理立 蔡玉洁 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期33-41,共9页

目的:探讨载脂蛋白E(APOE)基因多态性在神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用,为阿尔茨海默病(AD)发病机制的研究提供理论依据。方法:体外分离培养APOE基因敲除小鼠(APOE^(-/-))原代皮层星形胶质细胞,免疫荧光染色法鉴定细胞纯度。... 目的:探讨载脂蛋白E(APOE)基因多态性在神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用,为阿尔茨海默病(AD)发病机制的研究提供理论依据。方法:体外分离培养APOE基因敲除小鼠(APOE^(-/-))原代皮层星形胶质细胞,免疫荧光染色法鉴定细胞纯度。构建人APOE3和APOE4重组过表达质粒,分别转染至原代APOE^(-/-)星形胶质细胞中,以APOE^(-/-)原代细胞为对照,采用Western blotting法检测细胞中APOE和神经胶质酸性蛋白(GFAP)蛋白表达水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清中APOE水平。采用白细胞介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子(TNF)和补体C1q联合刺激转染APOE3和转染APOE4的原代星形胶质细胞制备炎症模型,分为APOE3+PBS组、APOE4+PBS组、APOE3+IL-1α+TNF+CC1q组和APOE4+IL-1α+TNF+C1q组,采用细胞免疫荧光染色法观察各组细胞形态表现,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(Gpc4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(Gpc6)、血小板反应蛋白1(Thbs1)、血小板反应蛋白2(Thbs2)、酸性分泌蛋白类似蛋白1(Sparcl1)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、C3和S100钙结合蛋白B(S100B)mRNA表达水平,微球吞噬实验检测各组细胞吞噬能力,Western blotting法检测各组细胞中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)蛋白表达水平。结果:与APOE^(-/-)组比较,转染APOE3和APOE4组细胞中APOE和GFAP蛋白表达水平及细胞培养上清中APOE水平明显升高(P<0.01)。荧光显微镜下观察,分别与APOE3+PBS组和APOE4+PBS组比较,APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组和APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组星形胶质细胞突起变短,胞体变大;与APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组比较,APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组星形胶质细胞突起更短。分别与APOE3+PBS组和APOE4+PBS组比较,APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组和APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组细胞中Gpc4、Gpc6、Thbs1、Thbs2和Sparcl1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01);与APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组比较,APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组细胞中Gpc4、Gpc6、Thbs1、Thbs2和Sparcl1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。分别与APOE3+PBS组和APOE4+PBS组比较,APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组和APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组细胞中GDNF mRNA表达水平明显降低(P<0.01),C3和S100B mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组比较,APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组细胞中GDNFmRNA表达水平明显降低(P<0.05),C3和S100B mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。分别与APOE3+PBS组和APOE4+PBS组比较,APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组和APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组细胞吞噬微珠数量明显减少;与APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组比较,APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组细胞吞噬微珠数量明显减少。分别与APOE3+PBS组和APOE4+PBS组比较,APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组和APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与APOE3+IL-1α+TNF+Cq1组比较,APOE4+IL-1α+TNF+Cq1组细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:APOE4基因型比APOE3诱导炎症因子能力更强,可诱导神经毒性反应性星形胶质细胞表型,增加神经毒性,影响星形胶质细胞凋亡,从而加剧神经元损伤。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 星形胶质细胞 载脂蛋白E 基因多态性 细胞凋亡 神经毒性

在线阅读 下载PDF 职称材料

心源性卒中的遗传学研究进展

5

作者 唐恒磊 郑树涛 +1 位作者 李友 钟望涛 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期373-386,共14页

心源性卒中是缺血性脑卒中的重要病因之一,表现出病情重、预后差和复发率高的特点。在遗传学研究中已经有相当多与心源性卒中相关的基因被鉴定,这些易感基因在疾病风险预测及危险因素评估的潜力也陆续被发掘。本文从全基因组关联研究、... 心源性卒中是缺血性脑卒中的重要病因之一,表现出病情重、预后差和复发率高的特点。在遗传学研究中已经有相当多与心源性卒中相关的基因被鉴定,这些易感基因在疾病风险预测及危险因素评估的潜力也陆续被发掘。本文从全基因组关联研究、拷贝数变异研究、全基因组测序研究等方面综述了心源性卒中遗传学研究的相关进展,并介绍了其遗传数据集在多基因风险评分、孟德尔随机化的应用,旨在为将来深入研究心源性卒中的遗传发生机制提供借鉴和参考。 展开更多

关键词 脑卒中 心源性卒中 全基因组关联研究 多基因风险评分 孟德尔随机化

在线阅读 下载PDF 职称材料

胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

6

作者 李胜男 何嘉文 +1 位作者 廖科棋 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1322-1329,共8页

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限... 目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。 展开更多

关键词 胞质分裂作用因子4 过表达慢病毒载体 Neuro-2a细胞 稳定转染 过表达慢病毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

EIF4A3 shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

7

作者 何嘉文 李友 +1 位作者 廖科棋 李胜男 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期831-839,共9页

目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和... 目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒GV493载体,构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒质粒,PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493空载质粒和GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为GV493对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为空白组、GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组,空白组不作处理,GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组分别采用相应慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,使用10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞的生长状态和绿色荧光表达情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中EIF4A3 mRNA及蛋白表达水平。结果:PCR测序结果显示GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒基因序列与设计合成的EIF4A3-shRNA序列一致,成功构建GV493-EIF4A3慢病毒载体。荧光显微镜观察可见HEK293T细胞荧光表达强烈,生长状态良好,慢病毒包装成功。GV493-对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒的滴度均为2×10~8 TU·mL^(-1),GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光,表明慢病毒感染稳定细胞系构建成功。RT-qPCR法,与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3shRNA组Neuro-2a细胞EIF4A3mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。Western blotting法,各组在相对分子质量49000处出现特异性条带,提示Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达成功;与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:成功构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒载体,建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系,为EIF4A3在颅内动脉粥样硬化的作用机制研究提供了参考。 展开更多

关键词 真核细胞翻译起始因子4A3 短发夹RNA 慢病毒 稳定转染细胞系 Neuro-2a细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定 被引量：1

8

作者 梁春梅 许旭三 +6 位作者 余华军 周霞 温霞 李友 KOJIC Snezana 汪亚君 马国达 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期766-771,I0002,共7页

目的:构建心脏阿霉素反应蛋白(CARP)基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素(ADR)心肌病中的作用及机制奠定基础。方法:将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA(shRNA)序列分别插入GV-358... 目的:构建心脏阿霉素反应蛋白(CARP)基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素(ADR)心肌病中的作用及机制奠定基础。方法:将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA(shRNA)序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果:基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍(P=0.01),shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%(P=0.02)。结论:成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。 展开更多

关键词 心脏阿霉素反应蛋白 RNA干扰 慢病毒 H9C2细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定 被引量：3

9

作者 李胜男 王梦旭 +3 位作者 胡伟东 陈少凤 陈杏兰 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期997-1002,I0001,共7页

目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin... 目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine2000将重组慢病毒质粒FV040Vector和FV040miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48h后收集慢病毒,以FV040Vector慢病毒作为对照组,FV040miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果:测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组(0.838 7±0.145 6)比较,实验组HEK293T细胞中miR-186表达水平(12.640 0±0.788 4)明显升高(t=14.72,P<0.01),约为对照组的15.07倍。结论:成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。 展开更多

关键词 miR-186 慢病毒 HEK293T细胞 过表达慢病毒载体 绿色荧光蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立 被引量：2

10

作者 李胜男 陈吴海 +3 位作者 陈少凤 邓福 朱佩仪 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1224-1230,I0016,共8页

目的:构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经Eco R... 目的:构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经Eco RⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK 293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK 293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数(MOI)为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果:PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10^8 TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10^8 TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%(t=11.44,P=0.0076)。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%(t=6.374,P=0.0078)。结论:成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平明显降低。 展开更多

关键词 RHBDF2 RNA干扰 慢病毒 HEK293T细胞Neuro-2a细胞 稳转细胞系

在线阅读 下载PDF 职称材料

RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞系的建立 被引量：2

11

作者 陈少凤 李胜男 +2 位作者 邓福 朱佩仪 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期444-450,共7页

目的:构建RHBDF2基因过表达慢病毒载体,建立稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞,为RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞的建立提供依据。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成引物,PCR扩增RHBDF2基因后通过Gatewa... 目的:构建RHBDF2基因过表达慢病毒载体,建立稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞,为RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞的建立提供依据。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成引物,PCR扩增RHBDF2基因后通过Gateway克隆技术将目的基因克隆至入门载体,再亚克隆至慢病毒载体pLV[Exp]-EGFP,构建重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2;将慢病毒表达载体质粒pLV[Exp]-EGFP和重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2分别与慢病毒辅助包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度;将感染pLV[Exp]-EGFP-control的EA.hy926细胞作为对照组,感染pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2的EA.hy926细胞作为实验组,利用嘌呤霉素筛选出稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞;荧光定量PCR(qPCR)和Western blotting法检测对照组和实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。结果:酶切电泳和测序检测,实验组过表达慢病毒载体的基因序列与设计合成的序列完全一致;对照组包装的慢病毒滴度为1×108 TU·mL-1,实验组慢病毒的滴度为3×108 TU·mL-1;荧光显微镜下慢病毒成功感染EA.hy926细胞,感染率达95%以上;qPCR检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA表达水平较对照组明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2蛋白表达水平较对照组明显升高(P<0.05)。结论:成功构建RHBDF2过表达慢病毒载体,利用pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒建立了稳定上调RHBDF2表达的EA.hy926细胞系。 展开更多

关键词 RHBDF2 慢病毒载体 HEK293T细胞 EA.hy926细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

SOX17过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建

12

作者 黄少婷 李友 +3 位作者 吴钊淳 何嘉文 廖科棋 李胜男 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期1424-1430,共7页

目的:构建性别决定区Y盒17 (SOX17)过表达慢病毒载体,使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。方法:在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列,将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接,构... 目的:构建性别决定区Y盒17 (SOX17)过表达慢病毒载体,使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。方法:在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列,将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接,构建GV492-SOX17过表达重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,筛选携带GV492-SOX17过表达重组质粒的阳性菌,克隆后测序。将GV492空载质粒和GV492-SOX17过表达重组质粒分别转染至人胚肾HEK 293T细胞中,转染48 h后收集GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将PC12细胞分为空白组、GV492对照组和GV492-SOX17组,空白组不作处理,GV492对照组和GV492-SOX17组分别采用相应慢病毒感染细胞(感染复数=100),10 mg·L^(-1)嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的PC12细胞,荧光显微镜观察各组PC12细胞生长状态及绿色荧光表达情况。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平。结果:GV492-SOX17过表达重组质粒的基因片段长度约为744 bp,GV492-SOX17过表达重组质粒基因序列与设计合成的SOX17过表达序列一致。GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒滴度均为2.5×108TU·mL^(-1)。各组PC12细胞生长状态良好且有绿色荧光表达。RT-qPCR法检测,与空白组和GV492对照组比较,GV492-SOX17组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量44 000处出现特异性条带,提示PC12细胞中SOX17蛋白表达成功;与空白组和GV492对照组比较,GV492-SOX17组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:成功构建了GV492-SOX17慢病毒表达载体,建立了稳定过表达GV492-SOX17的PC12细胞系。 展开更多

关键词 性别决定区Y盒17 慢病毒载体 PC12细胞 实时荧光定量PCR 感染复数

在线阅读 下载PDF 职称材料

GRK5过表达对P301S Tau转基因小鼠抑郁样行为的影响及其机制

13

作者 章天珍 沈洪涛 +2 位作者 龚正 赵斌 王岩 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期573-579,共7页

目的:探讨G蛋白偶联受体激酶5(GRK5)过表达对P301S Tau转基因小鼠抑郁样行为的影响,并阐明其可能的作用机制。方法:17只雄性P301S Tau小鼠随机分为空白对照组(n=6,不做任何处理)、阴性对照组(n=5,双侧海马区给予空载对照病毒)和过表达组... 目的:探讨G蛋白偶联受体激酶5(GRK5)过表达对P301S Tau转基因小鼠抑郁样行为的影响,并阐明其可能的作用机制。方法:17只雄性P301S Tau小鼠随机分为空白对照组(n=6,不做任何处理)、阴性对照组(n=5,双侧海马区给予空载对照病毒)和过表达组(n=6,双侧海马区给予GRK5过表达病毒)。糖水偏好实验检测各组小鼠糖水偏好率,悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)检测各组小鼠不动时间百分率,Western blotting法检测各组小鼠海马组织中神经功能相关蛋白表达水平,免疫荧光染色检测各组小鼠海马组织中小胶质细胞标记物抗体(IBA1)、神经元特异性核蛋白(NeuN)和胶质纤维酸蛋白(GFAP)表达情况。结果:糖水偏好实验检测,与空白对照组和阴性对照组比较,过表达组小鼠糖水偏好率升高(P<0.05)。TST和FST检测,与空白对照组和阴性对照组比较,过表达组小鼠不动时间百分率升高(P<0.05)。Western blotting法检测,与空白对照组和阴性对照组比较,过表达组小鼠海马组织中GRK5、Tau T205和IBA1蛋白表达水平升高(P<0.05),突触小泡蛋白(SYN)蛋白表达水平降低(P<0.05)。免疫荧光染色检测,与空白对照组比较,阴性对照组和过表达组小鼠海马组织中均有增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达,EGFP主要与NeuN发生共定位,小胶质细胞和星形胶质细胞中几乎未观察到EGFP;与空白对照组和阴性对照组比较,过表达组小鼠海马组织中小胶质细胞数增加(P<0.05)。结论:海马组织中GRK5过表达诱导P301S Tau小鼠抑郁样行为,其机制可能与GRK5在神经元核中表达水平升高有关。 展开更多

关键词 小鼠 P301S G蛋白偶联受体激酶5 抑郁样行为 TAU蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

miR-186海绵载体的构建及其在EA.hy926细胞株中的表达

14

作者 王梦旭 李胜男 +3 位作者 胡伟东 陈少凤 陈杏兰 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期498-503,I0002,共7页

目的:构建微小RNA-186(miR-186)基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法:化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到H... 目的:构建微小RNA-186(miR-186)基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法:化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度;FV040-control慢病毒作为对照组,FV040-miR-186-sponge作为实验组,分别感染EA.hy926细胞,筛选稳转细胞株;采用荧光定量PCR(qPCR)法检测空白对照组、FV040-control对照组及FV040-miR-186-sponge实验组中EA.hy926细胞miR-186的相对表达水平。结果:测序结果显示克隆的目的基因序列与设计的miR-186海绵体序列完全一致。在感染的EA.hy926细胞中观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。FV040-control包装的慢病毒滴度为2×108TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge组慢病毒滴度为6×108TU·mL^-1;成功建立了稳定表达miR-186-sponge的EA.hy926细胞株,感染效率达95%;qPCR检测,与空白对照组和FV040-control组比较,FV040-miR-186-sponge组EA.hy926细胞中miR-186相对表达水平降低(P<0.01)。结论:成功构建了miR-186基因的海绵载体,建立了稳定下调miR-186表达的EA.hy926-miR-186-sponge细胞株。 展开更多

关键词 微小RNA-186 海绵体 慢病毒 EA.hy926细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料