目的 本研究旨在探讨细胞外基质刚度变化对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的影响及其作用机制。方法 本研究基于成功构建脊髓损伤大鼠模型,并制备不同刚度(0.7 k Pa、40 k Pa)的聚丙烯酰胺凝胶基底,将大鼠原代NSCs于不同刚度...目的 本研究旨在探讨细胞外基质刚度变化对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的影响及其作用机制。方法 本研究基于成功构建脊髓损伤大鼠模型,并制备不同刚度(0.7 k Pa、40 k Pa)的聚丙烯酰胺凝胶基底,将大鼠原代NSCs于不同刚度基底上培养。压电型机械敏感离子通道组件1 (piezo type mechanosensitive ion channel component 1,Piezo1) sh RNA质粒转染NSCs细胞。免疫荧光染色检测神经元标志物双皮质醇(doublecortion,DCX)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性细胞百分比。免疫组织化学及蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测损伤组织及NSCs细胞中Piezo1蛋白的表达水平。结果 与0.7 k Pa基质刚度组相比,40 k Pa基质刚度组中DCX阳性细胞数增加,而GFAP阳性细胞数减少,Piezo1蛋白表达量上升。脊髓损伤大鼠损伤组织Piezo1蛋白表达显著高于空白对照(sham)组。40 k Pa基质刚度条件下沉默Piezo1后,DCX阳性细胞数减少,而GFAP阳性细胞数增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。机制研究发现,沉默Piezo1导致IV型胶原及纤连蛋白表达下降。重组纤连蛋白逆转了Piezo1 sh RNA对NSCs分化的影响,即DCX阳性细胞数增加,而GFAP阳性细胞数减少。结论 综上可见,硬基底刚度通过促进Piezo1蛋白表达,上调IV型胶原及纤连蛋白表达,从而调控NSCs细胞分化。本研究为基于生物材料治疗脊髓损伤提供了新的视角。展开更多
目的:研究Kinesin-3家族成员蛋白(Kinesin-3 family member1A,KIF1A)对氧糖剥夺-再灌注诱导的PC12细胞活力、自噬和凋亡的影响,为进一步研究KIF1A在脊髓缺血再灌注损伤治疗方面提供理论依据。方法:PC12细胞(美国ATCC公司)分为四组:A组,...目的:研究Kinesin-3家族成员蛋白(Kinesin-3 family member1A,KIF1A)对氧糖剥夺-再灌注诱导的PC12细胞活力、自噬和凋亡的影响,为进一步研究KIF1A在脊髓缺血再灌注损伤治疗方面提供理论依据。方法:PC12细胞(美国ATCC公司)分为四组:A组,对照组,无处理;B组,氧糖剥夺再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)组,PC12细胞用无糖DMEM培养基,于含混合气体(95%N2和5%CO2)的37℃恒温箱内密闭缺氧培养4h;C组,pcDNA3.1空质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1空质粒48h,进行OGD/R处理;D组,pcDNA3.1-KIF1A质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1-KIF1A质粒48h,进行OGD/R处理。B、C、D组经OGD/R处理后,更换常规培养基,正常孵育24h,收集细胞总RNA及蛋白质,进行实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT PCR)和Western blot检测KIF1A mRNA和蛋白的表达情况;CCK8检测细胞存活率变化;凋亡ELISA及Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡及Caspase-3活性;Western blot检测各组自噬相关基因LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的蛋白表达变化。结果:与A组(1.00±0.00)相比,B组细胞KIF1A mRNA(0.41±0.05)和蛋白表达水平(0.52±0.07,P<0.05)显著下调;细胞活力[(51.60±7.35)%,P<0.05]显著降低。与B组(1.00±0.00)相比,C组空质粒对KIF1A mRNA(0.91±0.13)及蛋白质(1.08±0.08)表达,细胞活力[(51.60±7.35)%vs(47.30±4.16)%],细胞凋亡(1.95±0.18 vs 2.08±0.16,P>0.05)等无显著影响。而D组KIF1A过表达后能显著上调KIF1A mRNA(2.63±0.16)以及蛋白表达(2.51±0.18,P<0.05),显著缓解OGD/R引起的细胞存活率下降[(51.60±7.35)%vs(86.40±9.03)%]及凋亡[1.95±0.18 vs 1.36±0.12,P<0.05];与B组相比,D组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(1.68±0.14 vs 1.19±0.09,P<0.05)及pmTOR的表达(1.00±0.00 vs 1.26±0.02,P<0.05)显著受抑制,P62表达显著升高(0.53±0.05 vs 0.89±0.09,P<0.05)。结论:KIF1A过表达可促进缺血再灌注损伤诱导的PC12细胞存活、抑制细胞自噬与凋亡,其机制可能与抑制mTOR通路相关。展开更多
文摘目的 本研究旨在探讨细胞外基质刚度变化对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的影响及其作用机制。方法 本研究基于成功构建脊髓损伤大鼠模型,并制备不同刚度(0.7 k Pa、40 k Pa)的聚丙烯酰胺凝胶基底,将大鼠原代NSCs于不同刚度基底上培养。压电型机械敏感离子通道组件1 (piezo type mechanosensitive ion channel component 1,Piezo1) sh RNA质粒转染NSCs细胞。免疫荧光染色检测神经元标志物双皮质醇(doublecortion,DCX)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性细胞百分比。免疫组织化学及蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测损伤组织及NSCs细胞中Piezo1蛋白的表达水平。结果 与0.7 k Pa基质刚度组相比,40 k Pa基质刚度组中DCX阳性细胞数增加,而GFAP阳性细胞数减少,Piezo1蛋白表达量上升。脊髓损伤大鼠损伤组织Piezo1蛋白表达显著高于空白对照(sham)组。40 k Pa基质刚度条件下沉默Piezo1后,DCX阳性细胞数减少,而GFAP阳性细胞数增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。机制研究发现,沉默Piezo1导致IV型胶原及纤连蛋白表达下降。重组纤连蛋白逆转了Piezo1 sh RNA对NSCs分化的影响,即DCX阳性细胞数增加,而GFAP阳性细胞数减少。结论 综上可见,硬基底刚度通过促进Piezo1蛋白表达,上调IV型胶原及纤连蛋白表达,从而调控NSCs细胞分化。本研究为基于生物材料治疗脊髓损伤提供了新的视角。
文摘目的:研究Kinesin-3家族成员蛋白(Kinesin-3 family member1A,KIF1A)对氧糖剥夺-再灌注诱导的PC12细胞活力、自噬和凋亡的影响,为进一步研究KIF1A在脊髓缺血再灌注损伤治疗方面提供理论依据。方法:PC12细胞(美国ATCC公司)分为四组:A组,对照组,无处理;B组,氧糖剥夺再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)组,PC12细胞用无糖DMEM培养基,于含混合气体(95%N2和5%CO2)的37℃恒温箱内密闭缺氧培养4h;C组,pcDNA3.1空质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1空质粒48h,进行OGD/R处理;D组,pcDNA3.1-KIF1A质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1-KIF1A质粒48h,进行OGD/R处理。B、C、D组经OGD/R处理后,更换常规培养基,正常孵育24h,收集细胞总RNA及蛋白质,进行实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT PCR)和Western blot检测KIF1A mRNA和蛋白的表达情况;CCK8检测细胞存活率变化;凋亡ELISA及Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡及Caspase-3活性;Western blot检测各组自噬相关基因LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的蛋白表达变化。结果:与A组(1.00±0.00)相比,B组细胞KIF1A mRNA(0.41±0.05)和蛋白表达水平(0.52±0.07,P<0.05)显著下调;细胞活力[(51.60±7.35)%,P<0.05]显著降低。与B组(1.00±0.00)相比,C组空质粒对KIF1A mRNA(0.91±0.13)及蛋白质(1.08±0.08)表达,细胞活力[(51.60±7.35)%vs(47.30±4.16)%],细胞凋亡(1.95±0.18 vs 2.08±0.16,P>0.05)等无显著影响。而D组KIF1A过表达后能显著上调KIF1A mRNA(2.63±0.16)以及蛋白表达(2.51±0.18,P<0.05),显著缓解OGD/R引起的细胞存活率下降[(51.60±7.35)%vs(86.40±9.03)%]及凋亡[1.95±0.18 vs 1.36±0.12,P<0.05];与B组相比,D组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(1.68±0.14 vs 1.19±0.09,P<0.05)及pmTOR的表达(1.00±0.00 vs 1.26±0.02,P<0.05)显著受抑制,P62表达显著升高(0.53±0.05 vs 0.89±0.09,P<0.05)。结论:KIF1A过表达可促进缺血再灌注损伤诱导的PC12细胞存活、抑制细胞自噬与凋亡,其机制可能与抑制mTOR通路相关。
