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猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备
被引量：
1
1
作者
赵梓桥
张昆丽
+4 位作者
张春红
翟少伦
康欣桐
黄淑坚
张建峰
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第6期1798-1806,共9页
【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至p...
【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白,采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫沉淀(IP)试验对其进行鉴定。【结果】成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N,获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达,大小约69 kD,经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带,经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL,获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000,可特异性识别pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白,且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】成功构建高效PDCoV-N原核表达系统,获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白,制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高,具有较强亲和力和特异性,可用于Western blotting、IFA和IP检测。
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关键词
猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)
N蛋白
原核表达
多克隆抗体
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职称材料
题名
猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备
被引量：
1
1
作者
赵梓桥
张昆丽
张春红
翟少伦
康欣桐
黄淑坚
张建峰
机构
佛山
科学
技术
学院
生命
科学
与工程
学院
广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/广东省动物疫病野外科学观测研究站
出处
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第6期1798-1806,共9页
基金
国家重点研发计划项目(2022YFD1800801-02)
广东省自然科学基金面上项目(2023A1515012153)
科技创新战略专项(高水平农科院建设)—人才项目(R2019YJ-YB2005,R2023PY-QY013)。
文摘
【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白,采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫沉淀(IP)试验对其进行鉴定。【结果】成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N,获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达,大小约69 kD,经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带,经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL,获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000,可特异性识别pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白,且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】成功构建高效PDCoV-N原核表达系统,获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白,制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高,具有较强亲和力和特异性,可用于Western blotting、IFA和IP检测。
关键词
猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)
N蛋白
原核表达
多克隆抗体
Keywords
porcine deltacoronavirus(PDCoV)
N protein
prokaryotic expression
polyclonal antibody
分类号
S852.65 [农业科学—基础兽医学]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
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1
猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备
赵梓桥
张昆丽
张春红
翟少伦
康欣桐
黄淑坚
张建峰
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024
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