目的肝星状细胞(HSC)和硫化氢(H2S)信号分子作为肝细胞癌(HCC)微环境中重要的组分,参与调控HCC的发生发展等多种生物学进程。本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养,探讨HSC通过分泌H2S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法以HSC细胞系(...目的肝星状细胞(HSC)和硫化氢(H2S)信号分子作为肝细胞癌(HCC)微环境中重要的组分,参与调控HCC的发生发展等多种生物学进程。本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养,探讨HSC通过分泌H2S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法以HSC细胞系(LX-2)及肝癌细胞系(Hep G2、PLC/PRF/5)为研究对象。RT-q PCR和Western Blot(WB)法检测LX-2中H2S关键合成酶——胱硫醚γ-裂解酶(CSE)m RNA及表达水平;ELISA测定上清液LX-2产生的H2S浓度;二代测序、细胞免疫荧光、染色质免疫沉淀(Ch IP)及WB检测H2S(内源性和外源性)作用Hep G2和PLC/PRF/5细胞后,JNK/Jun B-TNFSF14信号通路基因、结合位点及相关蛋白。Transwell小室将LX-2分别与Hep G2和PLC/PRF/5共培养,CCK-8和流式细胞术检测肝癌细胞的细胞活力、凋亡,WB测定H2S-TNFSF14信号通路相关蛋白。所有细胞实验均重复3次。计量资料两组间比较采用成组t检验;多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析,进一步两两比较采用Dunnett-t检验。结果LX-2主要通过CSE合成H2S,LX-2培养上清液中H2S浓度随着时间延长逐渐增加[(22.89±0.08)pg/m L vs(28.29±0.15)pg/m L vs(36.19±1.90)pg/m L,F=79.63,P<0.05]。LX-2中CSE m RNA水平显著高于CBS m RNA和MPST m RNA(1.008±0.13 vs 0.320±0.014 vs 0.05±0.02,F=80.84,P<0.05)。当CSE被炔丙基甘氨酸(PPG)抑制之后,随着PPG浓度增加,H2S浓度下降(P<0.05)。LX-2分别与Hep G2、PLC/PRF/5共培养,随着培养时间延长,Hep G2(87.48%±0.82%vs70.48%±0.641%vs 52.89%±0.57%vs 45.20%±0.69%,F=1517.13,P<0.001)和PLC/PRF/5(92.41%±0.48%vs 74.10%±0.73%vs 53.70%±0.60%vs 44.00%±0.27%,F=2626.21,P<0.001)细胞活力降低;凋亡增加(Hep G2:12.88%±0.64%vs15.5%±0.16%vs 18.43%±0.37%vs 13.01%±0.58%,F=142.15,P<0.001;PLC/PRF/5:8.51±0.05 vs 12.80±0.33 vs 15.59±0.21 vs 10.72±0.30,F=676.40,P<0.001),第3天最显著。二代测序显示,内源性H2S(LX-2产生)和Na HS(外源性H2S供体)参与调控Hep G2中多种基因表达。Na HS和LX-2通过释放H2S,激活肝癌细胞中JNK/Jun B信号通路、上调凋亡基因TNFSF14表达,且p-Jun B与TNFSF14基因转录调控区域结合增加。结论在肝癌微环境中,HSC通过信号分子CSE/H2S,激活了肝癌细胞中JNK/Jun B信号通路,TNFSF14表达增加,从而促进了肝癌细胞凋亡。展开更多
目的:探讨hsa-miR-103a-3p影响食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞对奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)耐药的机制。方法:采用RT-qPCR验证测序结果中hsa-miR-103a-3p在不同ESCC细胞系中的表达;转染hsa-miR-103a-3p m...目的:探讨hsa-miR-103a-3p影响食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞对奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)耐药的机制。方法:采用RT-qPCR验证测序结果中hsa-miR-103a-3p在不同ESCC细胞系中的表达;转染hsa-miR-103a-3p mimics或inhibitor,验证hsa-miR-103a-3p是否可以逆转ESCC细胞系的耐药表型。应用双萤光素酶报告基因实验和RT-qPCR验证hsa-miR-103a-3p与RASSF8(Ras association domain family member 8)的靶向调控关系;挽救实验验证改变RASSF8的表达是否可以逆转由hsa-miR-103a-3p引起的耐药表型。PCR-array实验检测hsa-miR-103a-3p参与ESCC的耐药机制;Kaplan-Meier生存分析预测hsa-miR-103a-3p高表达与患者生存时间的关系。结果:hsa-miR-103a-3p在OXA敏感ESCC细胞系中高表达(P<0.05);hsa-miR-103a-3p的表达影响ESCC细胞对OXA的敏感性(P<0.05);与对照组相比,过表达hsa-miR-103a-3p能够降低RASSF83’端非翻译区萤光素酶报告基因质粒的活性(P<0.05);挽救实验结果显示,改变RASSF8的表达可有效挽救由hsa-miR-103a-3p引起的耐药表型(P<0.05)。PCR-array实验结果显示,RASSF8高表达能够促进XPA(xeroderma pigmentosum complementation group A)和XPC(xeroderma pigmentosum complementation group C)表达。配对t检验分析结果显示,hsamiR-103a-3p在肿瘤组织中高表达;Kaplan-Meier生存分析显示,与hsa-miR-103a-3p低表达的患者相比,hsa-miR-103a-3p高表达的患者生存时间显著缩短(P<0.05)。结论:hsa-miR-103a-3p低表达通过靶向上调RASSF8的表达促进ESCC细胞对OXA耐药。展开更多
文摘目的肝星状细胞(HSC)和硫化氢(H2S)信号分子作为肝细胞癌(HCC)微环境中重要的组分,参与调控HCC的发生发展等多种生物学进程。本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养,探讨HSC通过分泌H2S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法以HSC细胞系(LX-2)及肝癌细胞系(Hep G2、PLC/PRF/5)为研究对象。RT-q PCR和Western Blot(WB)法检测LX-2中H2S关键合成酶——胱硫醚γ-裂解酶(CSE)m RNA及表达水平;ELISA测定上清液LX-2产生的H2S浓度;二代测序、细胞免疫荧光、染色质免疫沉淀(Ch IP)及WB检测H2S(内源性和外源性)作用Hep G2和PLC/PRF/5细胞后,JNK/Jun B-TNFSF14信号通路基因、结合位点及相关蛋白。Transwell小室将LX-2分别与Hep G2和PLC/PRF/5共培养,CCK-8和流式细胞术检测肝癌细胞的细胞活力、凋亡,WB测定H2S-TNFSF14信号通路相关蛋白。所有细胞实验均重复3次。计量资料两组间比较采用成组t检验;多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析,进一步两两比较采用Dunnett-t检验。结果LX-2主要通过CSE合成H2S,LX-2培养上清液中H2S浓度随着时间延长逐渐增加[(22.89±0.08)pg/m L vs(28.29±0.15)pg/m L vs(36.19±1.90)pg/m L,F=79.63,P<0.05]。LX-2中CSE m RNA水平显著高于CBS m RNA和MPST m RNA(1.008±0.13 vs 0.320±0.014 vs 0.05±0.02,F=80.84,P<0.05)。当CSE被炔丙基甘氨酸(PPG)抑制之后,随着PPG浓度增加,H2S浓度下降(P<0.05)。LX-2分别与Hep G2、PLC/PRF/5共培养,随着培养时间延长,Hep G2(87.48%±0.82%vs70.48%±0.641%vs 52.89%±0.57%vs 45.20%±0.69%,F=1517.13,P<0.001)和PLC/PRF/5(92.41%±0.48%vs 74.10%±0.73%vs 53.70%±0.60%vs 44.00%±0.27%,F=2626.21,P<0.001)细胞活力降低;凋亡增加(Hep G2:12.88%±0.64%vs15.5%±0.16%vs 18.43%±0.37%vs 13.01%±0.58%,F=142.15,P<0.001;PLC/PRF/5:8.51±0.05 vs 12.80±0.33 vs 15.59±0.21 vs 10.72±0.30,F=676.40,P<0.001),第3天最显著。二代测序显示,内源性H2S(LX-2产生)和Na HS(外源性H2S供体)参与调控Hep G2中多种基因表达。Na HS和LX-2通过释放H2S,激活肝癌细胞中JNK/Jun B信号通路、上调凋亡基因TNFSF14表达,且p-Jun B与TNFSF14基因转录调控区域结合增加。结论在肝癌微环境中,HSC通过信号分子CSE/H2S,激活了肝癌细胞中JNK/Jun B信号通路,TNFSF14表达增加,从而促进了肝癌细胞凋亡。
文摘目的:探讨hsa-miR-103a-3p影响食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞对奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)耐药的机制。方法:采用RT-qPCR验证测序结果中hsa-miR-103a-3p在不同ESCC细胞系中的表达;转染hsa-miR-103a-3p mimics或inhibitor,验证hsa-miR-103a-3p是否可以逆转ESCC细胞系的耐药表型。应用双萤光素酶报告基因实验和RT-qPCR验证hsa-miR-103a-3p与RASSF8(Ras association domain family member 8)的靶向调控关系;挽救实验验证改变RASSF8的表达是否可以逆转由hsa-miR-103a-3p引起的耐药表型。PCR-array实验检测hsa-miR-103a-3p参与ESCC的耐药机制;Kaplan-Meier生存分析预测hsa-miR-103a-3p高表达与患者生存时间的关系。结果:hsa-miR-103a-3p在OXA敏感ESCC细胞系中高表达(P<0.05);hsa-miR-103a-3p的表达影响ESCC细胞对OXA的敏感性(P<0.05);与对照组相比,过表达hsa-miR-103a-3p能够降低RASSF83’端非翻译区萤光素酶报告基因质粒的活性(P<0.05);挽救实验结果显示,改变RASSF8的表达可有效挽救由hsa-miR-103a-3p引起的耐药表型(P<0.05)。PCR-array实验结果显示,RASSF8高表达能够促进XPA(xeroderma pigmentosum complementation group A)和XPC(xeroderma pigmentosum complementation group C)表达。配对t检验分析结果显示,hsamiR-103a-3p在肿瘤组织中高表达;Kaplan-Meier生存分析显示,与hsa-miR-103a-3p低表达的患者相比,hsa-miR-103a-3p高表达的患者生存时间显著缩短(P<0.05)。结论:hsa-miR-103a-3p低表达通过靶向上调RASSF8的表达促进ESCC细胞对OXA耐药。
