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肝细胞生长因子基因转染对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响 被引量：2
1
作者 常冰梅 李美宁 +3 位作者 刘志贞 张悦红 程牛亮 牛勃 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期686-690,共5页
目的:观察HGF基因对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响。方法:从已有质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-HGF,酶切及测序鉴定正确后,用脂质体将重组质粒pEGFP-HGF转染... 目的:观察HGF基因对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响。方法:从已有质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-HGF,酶切及测序鉴定正确后,用脂质体将重组质粒pEGFP-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达细胞克隆,采用荧光显微镜观察、RT-PCR、免疫细胞化学方法检测鉴定重组质粒的表达情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测稳定表达细胞中HGF的含量;再以MTT法检测转染重组质粒后细胞增殖的改变,Transwell Migration实验检测细胞迁移能力的改变。结果:所构建重组质粒经酶切图谱分析和序列测定证实构建成功;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR证实HGFmRNA在转染阳性细胞高表达;免疫细胞化学证实转染pEGFP-HGF质粒的细胞有HGF蛋白的表达;ELISA检测细胞培养基中HGF含量可达112.3 ng/ml,MTT法、TranswellMigration测定转染pEGFP-HGF阳性细胞的增殖、迁移能力明显高于对照组(P<0.01)。结论:重组质粒pEGFP-HGF能够在内皮细胞株ECV304转录、表达;表达的活性蛋白HGF刺激ECV304的增殖、迁移,为进一步应用于基因治疗奠定实验基础。 展开更多
关键词 HGF基因 内皮细胞 增殖 迁移
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将RGD模体改变为RGDNM可减弱Echistatin对血小板聚集的抑制但增强血管新生的抑制作用 被引量：1
2
作者 杨涛 牛勃 +3 位作者 程牛亮 解军 张悦红 杨利军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期834-838,共5页
为了研究去整合素echistatin RGD(Arg-Gly-Asp)模体周边氨基酸突变后对其生物学功能的影响,根据echistatin序列设计合成6个片段,利用重叠延伸PCR法合成cDNA,使echistatin RGD模体周边序列变为ARGDNM(D27→N),与载体pTXB1连接后转化E.col... 为了研究去整合素echistatin RGD(Arg-Gly-Asp)模体周边氨基酸突变后对其生物学功能的影响,根据echistatin序列设计合成6个片段,利用重叠延伸PCR法合成cDNA,使echistatin RGD模体周边序列变为ARGDNM(D27→N),与载体pTXB1连接后转化E.coliBL21(DE3),建立echistatin(ARGDNM)的表达体系.工程菌经IPTG诱导后融合蛋白表达量占菌体总蛋白约30%,几丁质亲和纯化后,DTT裂解释放目的蛋白分子量约5.4kD.体外血小板聚集和体内鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)血管新生实验结果表明,echistatin(ARGDNM)抑制血小板聚集的作用减弱,而其抑制血管新生的作用增强.RGD模体周围氨基酸的改变影响了去整合素的生物学功能,echistatin(ARGDNM)增强了与αⅤβ3结合的特异性,本工作为研究特异性更强的去整合素药物奠定了基础. 展开更多
关键词 去整合素 ECHISTATIN RGD(Arg-Gly-Asp) 突变
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NK4蛋白在大肠埃希菌中的表达、纯化、复性及活性测定 被引量：1
3
作者 常冰梅 刘晓军 +3 位作者 李美宁 张悦红 程牛亮 牛勃 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期60-65,共6页
目的在大肠埃希菌(E.coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性。方法采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E.coliBL21(DE3),温控诱导表达目的蛋白NK4。蛋... 目的在大肠埃希菌(E.coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性。方法采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E.coliBL21(DE3),温控诱导表达目的蛋白NK4。蛋白鉴定采用SDS-PAGE和Western blot;蛋白纯化采用包涵体超声破碎、洗涤和Sephacryl-S200凝胶过滤层析。经梯度稀释复性后,采用MTT法和免疫细胞化学方法检测重组蛋白NK4对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)ECV304增殖的作用。结果重组质粒pBV220-NK4酶切图谱和序列测定与预期一致。SDS-PAGE显示有相对分子质量49 000的目的蛋白,表达量为30%。Western blot结果证实目的蛋白带有NK4的氨基端,经包涵体洗涤、层析后NK4的纯度为95%。复性后的NK4可抑制ECV304增殖,并抑制ECV304增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclearantigen,PCNA)的表达。结论我们建立了NK4的原核高表达体系及纯化制备工艺,所制备的NK4蛋白具有生物学活性,为大规模制备有活性的NK4及深入研究其相关功能奠定了基础。 展开更多
关键词 NK4 原核表达 纯化 活性测定
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