枯草芽孢杆菌细菌素的分离、表达及稳定性分析 被引量：3

1

作者 于秀菊 张敏爱 +4 位作者 胡燕姣 朱芷葳 王海东 杨丽华 范阔海 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期323-333,共11页

旨在分离枯草芽孢杆菌及其所产细菌素,并分析重组表达后的细菌素的抑菌活性和稳定性。通过牛津杯扩散法筛选羊驼粪便中高产细菌素的芽孢杆菌;借助16S rRNA鉴定分离菌;采用硫酸铵沉淀、氯仿抽提、SDS-PAGE、质谱分析等技术获得细菌素的... 旨在分离枯草芽孢杆菌及其所产细菌素,并分析重组表达后的细菌素的抑菌活性和稳定性。通过牛津杯扩散法筛选羊驼粪便中高产细菌素的芽孢杆菌;借助16S rRNA鉴定分离菌;采用硫酸铵沉淀、氯仿抽提、SDS-PAGE、质谱分析等技术获得细菌素的氨基酸序列;利用大肠杆菌表达系统对细菌素进行体外表达,并利用牛津杯扩散法测定其抑菌活性和稳定性。结果显示,分离菌是一种枯草芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌SXAU18,其可产生抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特菌生长的细菌素;枯草芽孢杆菌SXAU18所产细菌素可能是分子量为10~20 ku的DarA蛋白和两种未知蛋白,属于类细菌素的范畴,将未知蛋白分别命名为BLIS SXAU181和182;经原核表达的BLIS SXAU181和182主要以可溶性上清蛋白形式表达,纯化后为单一条带;重组BLIS SXAU181蛋白没有抑菌活性,重组BLIS SXAU182蛋白具有良好的抑菌活性,且具有耐高温、耐酸碱、耐人工胃液和肠液的的特性。综上,本研究从枯草芽孢杆菌SXAU18分离到具有抑制革兰阳性菌生长活性的细菌素,且重组表达后的BLIS SXAU182具有良好的抑菌活性和和稳定性。 展开更多

关键词 枯草芽孢杆菌 细菌素 分离 表达 稳定性

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苦参碱对昆明小鼠粪便及血浆代谢物的影响 被引量：1

2

作者 孙娜 曹志刚 +6 位作者 张华 王弘 孙盼盼 孙耀贵 范阔海 尹伟 李宏全 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期2364-2379,共16页

基于非靶向代谢组学技术,分析腹腔注射苦参碱前后昆明小鼠粪便和血浆代谢物的差异,并通过与此前16S rDNA测序结果联合分析探究苦参碱发挥药理作用的可能机理。将20只昆明小鼠随机分为2组,分别是苦参碱处理组(MT)和生理盐水处理组(NC)。... 基于非靶向代谢组学技术,分析腹腔注射苦参碱前后昆明小鼠粪便和血浆代谢物的差异,并通过与此前16S rDNA测序结果联合分析探究苦参碱发挥药理作用的可能机理。将20只昆明小鼠随机分为2组,分别是苦参碱处理组(MT)和生理盐水处理组(NC)。苦参碱处理组每天腹腔注射40 mg·kg^(-1)的苦参碱,连续给药5 d,每天给药2次。生理盐水处理组按照同样方式和体积腹腔注射生理盐水。给药第6天,分别收集各组小鼠的粪便和血浆,进行非靶向代谢组学检测,并与苦参碱处理组肠道菌群的16S rDNA测序结果进行联合分析。苦参碱处理组的粪便及血浆中均存在显著差异代谢物,粪便中共鉴定出97种,血浆中有44种。聚类分析显示,粪便中苦参碱组有35种代谢物上调,104种代谢物下调;血浆中苦参碱组有20种代谢物上调,35种代谢物下调。KEGG通路分析显示粪便及血浆差异代谢物被映射到Protein digestion and absorption等代谢途径。与16S rDNA测序分析得到的显著差异菌种嗜酸乳杆菌关联分析,结果表明粪便及血浆代谢物与嗜酸乳杆菌存在相关性。苦参碱可调节昆明小鼠的体内代谢,在粪便和血浆中均存在显著差异代谢物。这些差异代谢物及与菌群之间的互作可能是其发挥药理作用的关键。 展开更多

关键词 苦参碱 昆明小鼠 非靶向代谢组学 肠道菌群 联合分析

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NFATc1在小鼠毛囊生长周期中的定位和表达

3

作者 范阔海 张敏爱 +3 位作者 胡燕姣 刘艺 王慧荣 于秀菊 《山西农业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2022年第4期113-118,共6页

[目的]本研究旨在探究活化T细胞c1核因子(nuclear factor of activated T⁃cells,cytoplasmic 1,NFATc1)在小鼠毛囊生长周期中的组织定位和表达。[方法]以ICR小鼠毛囊生长期、退化期和相对静止期的背部皮肤组织为试验材料,运用免疫组织... [目的]本研究旨在探究活化T细胞c1核因子(nuclear factor of activated T⁃cells,cytoplasmic 1,NFATc1)在小鼠毛囊生长周期中的组织定位和表达。[方法]以ICR小鼠毛囊生长期、退化期和相对静止期的背部皮肤组织为试验材料,运用免疫组织化学、荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测NFATc1在小鼠不同毛囊生长时期皮肤中的组织定位情况、mRNA和蛋白表达量的差异性。[结果]NFATc1在小鼠毛囊的各个生长周期均有表达,阳性反应物主要位于毛囊的膨大部,其次位于根鞘、皮脂腺和表皮,在退化期的膨大部呈现强阳性表达;NFATc1的mRNA和蛋白表达量在毛囊生长期、退化期和相对静止期均呈现“低表达⁃高表达⁃低表达”的规律。[结论]NFATc1在小鼠毛囊的周期性生长过程中发挥作用,与维持毛囊干细胞静止状态相关。 展开更多

关键词 ICR小鼠 活化T⁃细胞c1核因子 毛囊生长期 毛囊退化期 毛囊相对静止期

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基于16S rDNA测序分析腹腔注射苦参碱的昆明小鼠肠道菌群结构 被引量：7

4

作者 曹志刚 王弘 +8 位作者 张华 孙盼盼 李宏全 孙耀贵 杨惠珍 王建中 尹伟 范阔海 孙娜 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期618-627,共10页

旨在通过16S rDNA测序技术分析腹腔注射苦参碱的昆明小鼠肠道菌群的结构。本研究将20只昆明小鼠随机分为2组,分别是苦参碱组(MT组)和阴性对照组(NC组),连续腹腔给药5 d,每天给药2次,收集各组粪便和各肠段组织,进行β多样性、Lefse及Meta... 旨在通过16S rDNA测序技术分析腹腔注射苦参碱的昆明小鼠肠道菌群的结构。本研究将20只昆明小鼠随机分为2组,分别是苦参碱组(MT组)和阴性对照组(NC组),连续腹腔给药5 d,每天给药2次,收集各组粪便和各肠段组织,进行β多样性、Lefse及Metastats分析,qPCR检测差异菌种在各肠段的mRNA表达量,通过KEGG分析肠道菌群变化导致的代谢途径差异。稀释曲线结果显示,所测样本数据足以反映样品中物种多样性;β多样性分析结果显示,苦参碱可以调节肠道菌群的结构,Lefse及Metastats分析结果均显示,苦参碱显著增加了拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌目(Bacteroidales)、Muribaculaceae、益生菌嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的丰度,而显著减少了厚壁菌门(Firmicutes)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)的丰度。与Lefse及Metastats分析结果一致,qPCR结果显示苦参碱组小鼠粪便中嗜酸乳杆菌含量增加。同时,苦参碱可以增强嗜酸乳杆菌在各肠段的定植。通过KEGG分析发现,NC与MT组之间在聚糖的生物合成与代谢、运输与分解代谢等代谢途径存在显著差异。本研究结果表明,腹腔注射苦参碱可以显著改变昆明小鼠肠道菌群的结构,增加有益菌嗜酸乳杆菌在肠道中的定植,并造成了聚糖生物合成与代谢、运输与分解代谢等代谢途径的差异,为进一步揭示苦参碱发挥药效作用的机理奠定了基础。 展开更多

关键词 苦参碱 昆明小鼠 肠道菌群 16S rDNA测序 嗜酸乳杆菌

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基于网络药理学研究苦参抑菌活性成分及其作用机制 被引量：9

5

作者 吴雅琳 曹志刚 +6 位作者 孙盼盼 张华 尹伟 范阔海 孙耀贵 李宏全 孙娜 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期6055-6071,共17页

本研究基于网络药理学及分子对接技术探究苦参的主要抑菌药效成分及其作用机理,为开发其为新型饲料添加剂提供理论基础。通过中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP)预测苦参药效成分和靶点,并利用疾病数据库筛选抑菌靶点。利用Venny网站... 本研究基于网络药理学及分子对接技术探究苦参的主要抑菌药效成分及其作用机理,为开发其为新型饲料添加剂提供理论基础。通过中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP)预测苦参药效成分和靶点,并利用疾病数据库筛选抑菌靶点。利用Venny网站获取苦参药效靶点和抑菌靶点交集的靶点和韦恩图。利用STRING网站进行关键靶点蛋白相互作用(PPI)分析。基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析通过DAVID数据库在线分析。通过分子对接方法来确认关键药效成分与关键抑菌靶点之间的亲和力,并将对接结果作图。结果表明:经过一系列分析后,得到的苦参的药效成分、药物靶点、抑菌靶点、苦参和抑菌共同靶点分别是24、197、907、75个。PPI分析发现,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤蛋白P53(TP53)等32个蛋白可能是苦参抑菌作用的关键靶点。通过GO功能和KEGG富集分析,获得616个条目和156条通路。分子对接结果显示,度值排名前5位的活性成分(槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、8-异戊烯基山奈酚、菜豆素)和AKT1、TNF、TP53有较好的亲和力,AKT1、TNF、TP53可能是苦参发挥抑菌作用的主要靶点。通过分析得出,苦参主要通过槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素等主要药效成分作用于AKT1、TNF、TP53等靶点,通过白细胞介素-17(IL-17)、TNF、C型凝集素受体等信号通路发挥抑菌作用,该研究结果表明了苦参通过多成分、多靶点、多通路实现抑菌作用。 展开更多

关键词 苦参 网络药理学 抑菌活性 饲料添加剂

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咖啡酸对玉米赤霉烯酮诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用 被引量：4

6

作者 裴亚萍 赵瑾 +5 位作者 孙娜 孙盼盼 孙耀贵 范阔海 尹伟 李宏全 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期3068-3075,共8页

卵巢颗粒细胞通过与卵母细胞相互作用及其自身分泌作用为卵泡的形成和发育成熟提供特殊的微环境。多种有害刺激可引起颗粒细胞凋亡和代谢失调从而降低卵母细胞质量,对胚胎的形成产生负面影响。玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)是畜禽养殖... 卵巢颗粒细胞通过与卵母细胞相互作用及其自身分泌作用为卵泡的形成和发育成熟提供特殊的微环境。多种有害刺激可引起颗粒细胞凋亡和代谢失调从而降低卵母细胞质量,对胚胎的形成产生负面影响。玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)是畜禽养殖业中常见的造成卵巢颗粒细胞损伤的霉菌毒素,且缺少有效治疗药物。因此,本试验用ZEA造成小鼠卵巢颗粒细胞损伤,探究咖啡酸对ZEA诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用。通过机械法分离小鼠卵巢颗粒细胞;运用间接免疫荧光法对分离出的细胞进行鉴定;使用MTT法测定咖啡酸对正常小鼠卵巢颗粒细胞活性的影响;选取200、100和50μg·mL-1咖啡酸分别与ZEA共处理颗粒细胞,同时设置细胞对照组和ZEA模型组,24 h后显微镜观察细胞形态及贴壁情况,MTT法检测细胞活力;qRT-PCR技术检测caspase-3 mRNA的表达;Western blot检测cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白水平。结果发现,FSHR阳性染色大量出现在试验组细胞胞浆中,提示分离到的细胞是小鼠卵巢颗粒细胞;咖啡酸对卵巢颗粒细胞没有毒性作用且细胞活力均在90%以上;与空白对照组细胞相比,ZEA组细胞体积较小,贴壁较差,细胞间隙增大,细胞活力显著降低(P<0.001),caspase-3 mRNA相对表达量以及cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白表达水平显著升高(P<0.001),而给予咖啡酸处理后细胞间隙减小,贴壁紧密,细胞活力显著升高(P<0.001),显著降低ZEA诱导的caspase-3 mRNA含量增加(P<0.001),显著降低凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达(P<0.001)。本研究发现,咖啡酸可通过抑制ZEA诱导的细胞凋亡,恢复颗粒细胞活性。 展开更多

关键词 咖啡酸 玉米赤霉烯酮 卵巢颗粒细胞 细胞凋亡

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基于网络药理学和分子对接分析野黄芩苷抗卵泡闭锁的作用机制 被引量：4

7

作者 张新越 孙娜 +5 位作者 孙盼盼 张华 范阔海 尹伟 孙耀贵 李宏全 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2585-2593,共9页

【目的】基于网络药理学和分子对接方法探讨野黄芩苷抗卵泡闭锁的作用机制,以筛选野黄芩苷抗玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)致颗粒细胞损伤的作用途径。【方法】利用PharmMapper、TCMSP、SymMap和GeneCards数据库获得野黄芩苷发挥抗卵... 【目的】基于网络药理学和分子对接方法探讨野黄芩苷抗卵泡闭锁的作用机制,以筛选野黄芩苷抗玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)致颗粒细胞损伤的作用途径。【方法】利用PharmMapper、TCMSP、SymMap和GeneCards数据库获得野黄芩苷发挥抗卵泡闭锁作用的靶点,使用Cytoscape v 3.7.2软件构建靶蛋白互作网络关系图并筛选关键靶点;利用DAVID数据库对靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析,构建药物-靶点-通路网络图;使用AutoDock Tools 1.5.6软件进行分子对接验证。【结果】共获得34个交集靶点,筛选得到胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)、丝裂原活化激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)、G1/S-特异性周期蛋白-D1(G1/S-specific cyclin-D1,CCND1)、纤连蛋白1(fibronectin 1,FN1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、半胱天冬酶-3(caspase-3,CASP3)、神经源性基因位点切口同源物蛋白1(neurogenic locus notch homolog protein 1,NOTCH1)和白细胞介素6(interleukin 6,IL6)共9个核心靶点。GO功能富集分析得到基因表达调控、细胞增殖正调控、凋亡过程负调控等264个生物过程条目;线粒体、内质网、细胞质等25个细胞组分条目;生长因子活性、蛋白质结合、细胞外基质结构组成等23个分子功能条目。KEGG通路富集分析得到癌症通路、IL17信号通路、PI3K-Akt信号通路等115条相关通路。分子对接验证结果显示,野黄芩苷与9个核心靶点蛋白的结合能均<0 kJ/mol,说明蛋白可与野黄芩苷自发结合。【结论】野黄芩苷可能通过多靶点、多通路来治疗卵泡闭锁,本研究结果可为阐明野黄芩苷抗ZEA致颗粒细胞损伤的作用机制提供思路。 展开更多

关键词 网络药理学 分子对接 野黄芩苷 卵泡闭锁

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基于网络药理学和分子对接分析苦参碱抗PRRSV的作用机制 被引量：2

8

作者 郝江花 孙娜 +4 位作者 孙盼盼 孙耀贵 范阔海 尹伟 李宏全 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期809-819,共11页

本研究旨在利用网络药理学及分子对接技术从抗炎角度探讨苦参碱抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用机制。利用PharmMapper服务器和Genecards疾病数据库获得苦参碱发挥抗炎作用的潜在靶点;使用STRING在线分析平台结合Cytoscape软件... 本研究旨在利用网络药理学及分子对接技术从抗炎角度探讨苦参碱抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用机制。利用PharmMapper服务器和Genecards疾病数据库获得苦参碱发挥抗炎作用的潜在靶点;使用STRING在线分析平台结合Cytoscape软件构建靶蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络并进行拓扑学分析筛选关键靶点;利用DAVID数据库对靶点进行基因本体论GO富集分析以及KEGG通路富集分析,并使用Cytoscape软件进行“药物-靶点-通路”网络图的构建;使用Autodock Vina软件进行分子对接,选择最佳的结合靶点。网络分析结果表明,苦参碱抗炎的潜在靶点有23个;蛋白互作网络提示,IGFⅠ、MAPK8、CASP3、NR3C1可能是苦参碱抗炎的核心靶点;GO富集分析得到116个细胞生物学过程,KEGG通路富集分析得到47条相关信号通路;分子对接显示,MAPK8与苦参碱有较好亲和力,可能是苦参碱发挥抗炎作用的主要靶点。苦参碱可能通过作用于MAPK8这一关键蛋白发挥抗炎作用,进而达到抗PRRSV的作用。 展开更多

关键词 苦参碱 网络药理学 抗炎 靶点

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PAMs免疫粘附受体CR 1-like对PRRSV感染的影响 被引量：1

9

作者 张峥 孙雨晨 +5 位作者 范阔海 孙娜 孙盼盼 孙耀贵 李宏全 尹伟 《山西农业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2023年第2期100-110,共11页

[目的]本试验旨在探讨猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)表面天然免疫粘附受体—猪I型补体受体(Porcine complement receptor 1⁃like,CR1⁃like)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respi⁃ratory syndr... [目的]本试验旨在探讨猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)表面天然免疫粘附受体—猪I型补体受体(Porcine complement receptor 1⁃like,CR1⁃like)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respi⁃ratory syndrome virus,PRRSV)感染PAMs的影响,为阐述CR1⁃like在PRRSV免疫应答中的生物学功能提供理论数据。[方法]采取PRRSV减毒活疫苗免疫接种PRRSV抗体为阴性的长白仔猪20~28 d后,提取分离抗病毒血清并检测抗PRRSV血清中和效价;将抗PRRSV血清进行不同倍比稀释,制备各类PRRSV抗原抗体复合物并接种于PAMs上,建立抗体依赖性增强(Antibody⁃dependent enhancement,ADE)模型,qRT⁃PCR技术检测各时间点PRRSV N基因拷贝数变化;PRRSV感染PAMs 9 h后,将抗血清和猪新鲜血清共处理细胞,运用ELISA测定不同时间点细胞上清液中猪新鲜血清C3b、C4b、CH50总活性;将PAMs分为试验组(PRRSV感染PAMs 9 h后同时加入抗血清和猪新鲜血清)和6个对照组,采用qRT⁃PCR技术检测各组不同时间点胞内和上清中PRRSV N基因的拷贝数,确定猪新鲜血清对PRRSV感染PAMs的作用;采用免疫阻断技术将PAMs分为FcR McAb阻断组、CR1⁃like McAb阻断组、共阻断组及3个对照组,qRT⁃PCR技术检测PRRSV N基因拷贝数变化,确定免疫粘附受体CR1⁃like对PRRSV感染PAMs的影响。[结果]抗PRRSV血清在PAMs上的中和抗体效价为1∶5.37;qRT⁃PCR结果成功筛选出1:20稀释度的抗PRRSV血清对病毒的复制具有促进作用;ELISA检测猪新鲜血清C3b、C4b和CH50浓度随PRRSV感染时间延长呈降低趋势;qRT⁃PCR结果显示,猪新鲜血清可以与1∶20稀释度抗PRRSV血清协同促进PRRSV的复制;qRT⁃PCR、免疫阻断技术得出1∶20稀释度抗PRRSV血清、猪新鲜血清协同促进PRRSV感染增强不只依赖于FcR,还与CR1⁃like有关。[结论]体外条件下,PAMs表面的CR1⁃like是介导PRRSV感染PAMs过程中产生ADE效应的分子之一,可与FcR协同促进PRRSV感染PAMs。 展开更多

关键词 猪CR1⁃like 猪新鲜血清 免疫粘附 PRRSV PAMs

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基于网络药理学和分子对接探讨莪术醇抗脑心肌炎病毒的作用机制 被引量：1

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作者 孙盼盼 侯震 +5 位作者 郝至立 郑剑纲 孙娜 范阔海 尹伟 李宏全 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期341-348,共8页

【目的】利用网络药理学和分子对接技术发现莪术醇抗脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的作用靶点及机制。【方法】利用PharmMapper、GeneCards数据库获得莪术醇抗EMCV的相关靶点;通过Cytoscape 3.7.2软件、STRING和DAVID... 【目的】利用网络药理学和分子对接技术发现莪术醇抗脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的作用靶点及机制。【方法】利用PharmMapper、GeneCards数据库获得莪术醇抗EMCV的相关靶点;通过Cytoscape 3.7.2软件、STRING和DAVID数据库构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选关键靶点,对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建莪术醇抗EMCV靶点-通路网络;通过AutoDock Vina 1.1.2分析莪术醇与靶蛋白的结合能及结合模式。【结果】网络药理学分析结果显示,莪术醇抗EMCV的潜在靶点有9个,其中丝裂原活化激酶14(mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14)、信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、白蛋白(albumin,ALB)、白细胞介素2(interleukin 2,IL2)可能是莪术醇抗EMCV的核心靶点,所得靶点参与C型凝集素受体信号通路、神经营养素信号通路和JAK-STAT信号通路等代谢通路,功能涉及调节炎症反应细胞因子的产生、蛋白激酶活性和药物结合等;分子对接结果显示,4种核心靶蛋白与莪术醇之间存在较强的结合能,均存在疏水形式的结合,其中ALB、STAT1和IL2与莪术醇之间还存在氢键结合。【结论】本研究结果表明,MAPK14、STAT1、ALB和IL2是莪术醇发挥抗EMCV作用的潜在靶点,本研究为莪术醇作为抗EMCV药物的研发提供理论依据和线索。 展开更多

关键词 莪术醇 脑心肌炎病毒(EMCV) 网络药理学 分子对接 靶点

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猪圆环病毒2型感染树突状细胞外泌体中差异miRNA分析 被引量：1

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作者 上官琳晖 丁文文 +5 位作者 刘佳宇 范阔海 尹伟 孙娜 孙盼盼 李宏全 《山西农业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2023年第4期54-64,共11页

[目的]本研究旨在探究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染中,树突状细胞(Dendritic cell,DC)外泌体miRNA在调节免疫反应中的作用。[方法]以正常的单核细胞来源树突状细胞(MoDC)来源外泌体(DEX)为空白对照组,病毒感染的M... [目的]本研究旨在探究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染中,树突状细胞(Dendritic cell,DC)外泌体miRNA在调节免疫反应中的作用。[方法]以正常的单核细胞来源树突状细胞(MoDC)来源外泌体(DEX)为空白对照组,病毒感染的MoDC来源外泌体(VDEX)为试验组,使用间接免疫荧光评估感染模型鉴定外泌体后,通过高通量测序技术分析两者中的差异miRNA。[结果]间接免疫荧光结果显示,与PCV2共孵育的MoDC中有特异性绿色荧光,表明PCV2感染MoDC模型建立成功。纳米颗粒追踪技术结果显示,超速离心法提取的外泌体直径分别为130 nm和120 nm。Western blot结果显示,两组外泌体均存在特异性标记蛋白CD63和TSG101。高通量测序结果显示,与DEX组相比,VDEX组共504种miRNA发生显著变化(P<0.05),其中161种表达上调,343种表达下调。qPCR结果表明,与DEX相比,VDEX中sscmiR10b、sscmiR199a3pR1、sscmiR5325p、sscmiR4255p、sscmiR210、sscmiR144R+1、ssclet7c、sscmiR107R2、sscmiR225pR1和sscmiR2963pR+1表达量显著下降(P<0.05),与测序结果一致。GO分析显示,差异靶基因参与的生物学功能主要有转录调控(DNA模板)、RNA聚合酶Ⅱ对转录的正/负调控、信号转导和氧化还原等过程。KEGG通路分析发现,差异靶基因主要参与T细胞受体信号通路、Th17细胞分化通路、癌症通路、细胞内吞作用和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路等。通过差异miRNA显著性P值、Foldchange和KEGG富集分析,最终确定出个10目标miRNA。[结论]VDEX中差异性表达的miRNA及其靶基因通过调控T细胞的增殖分化来调节免疫反应。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 外泌体 微小核糖核酸 高通量测序 树突状细胞

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重组鸡CD40L对ND LaSota疫苗免疫效果的影响

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作者 刘佳宇 温慧之 +4 位作者 范阔海 尹伟 孙耀贵 孙盼盼 李宏全 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第11期44-48,共5页

本试验旨在评价毕赤酵母表达系统生产的重组鸡CD40L对新城疫LaSota疫苗免疫效果的影响。首先构建表达鸡CD40L的重组毕赤酵母菌株,经纯化培养上清获得重组鸡CD40L。再分别用剂量为1.0μg/羽和0.1μg/羽的重组鸡CD40L和新城疫LaSota疫苗... 本试验旨在评价毕赤酵母表达系统生产的重组鸡CD40L对新城疫LaSota疫苗免疫效果的影响。首先构建表达鸡CD40L的重组毕赤酵母菌株,经纯化培养上清获得重组鸡CD40L。再分别用剂量为1.0μg/羽和0.1μg/羽的重组鸡CD40L和新城疫LaSota疫苗联合免疫7日龄SPF鸡。于免疫后14、21、28 d和35 d通过血凝血抑试验检测血清中新城疫抗体水平,用商品试剂盒检测血清超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量。结果显示,重组鸡CD40L联合新城疫LaSota疫苗免疫不能增强疫苗诱导产生的血清抗体水平,不能提高鸡血清SOD活性,但能提高血清GSH-Px活性以及降低血清MDA含量。因此,在本试验所设剂量(1.0μg/羽和0.1μg/羽)下,重组鸡CD40L对疫苗无明显的免疫增效作用,但能够增强鸡的抗氧化能力。 展开更多

关键词 鸡 重组CD40L 新城疫疫苗 免疫效果

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鸡传染性法氏囊病病毒VP2与白喉毒素截短体DT390融合蛋白的真核表达及免疫原性检测

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作者 孟维金 范阔海 +3 位作者 常熊熊 尹伟 李宏全 王志瑞 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第12期4652-4660,共9页

为探究白喉毒素截短体DT390是否对鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白具有免疫增强作用,本研究利用有白喉毒素抗性的毕赤酵母表达系统对DT390和VP2进行融合表达,用SDS-PAGE和Western blotting方法对表... 为探究白喉毒素截短体DT390是否对鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白具有免疫增强作用,本研究利用有白喉毒素抗性的毕赤酵母表达系统对DT390和VP2进行融合表达,用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达的融合蛋白DT390-VP2进行了鉴定。将24只21日龄SPF雏鸡随机均分为4组:VP2组、DT390-VP2组、PBS(对照组)和B87组(阳性对照组),在第0和14天,分别对各组雏鸡进行免疫,在首免后第28天,每只雏鸡接种100 BID_(50)的IBDV BC6/85毒株,采用ELISA法检测免疫前后不同时间各组雏鸡血清的VP2特异性抗体水平,采用法氏囊组织切片HE染色及病理损伤评分来评价法氏囊的损伤程度,评价融合蛋白DT390-VP2在雏鸡体内的免疫原性和保护功能。SDS-PAGE和Western blotting分析结果显示,表达和提纯后的目的蛋白确为糖基化的融合蛋白DT390-VP2(91.26 ku)。体内试验结果显示,首次免疫21 d后,DT390-VP2组的VP2特异性抗体滴度分别显著和极显著高于B87组(P<0.05)和VP2组(P<0.01);首次免疫28 d后,DT390-VP2组的VP2特异性抗体滴度极显著高于VP2组(P<0.01);与VP2蛋白相比,融合蛋白DT390-VP2减轻了雏鸡法氏囊淋巴滤泡的萎缩程度。综上所述,白喉毒素截短体DT390以融合表达的方式增强了VP2的体液免疫原性,融合蛋白DT390-VP2在一定程度上减轻了IBDV BC6/85毒株造成的组织损伤。 展开更多

关键词 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2蛋白 DT390 免疫原性

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脑心肌炎病毒(EMCV)感染昆明小鼠模型的建立 被引量：1

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作者 郑剑纲 郝至立 +3 位作者 曹志刚 孙盼盼 孙娜 李宏全(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期2232-2237,共6页

目的:建立EMCV感染昆明小鼠模型。方法:6~8周龄昆明小鼠,雌雄各半,分为空白对照组和EMCV高(100TCID50/20 g)、中(10 TCID_(50)/20 g)、低(1 TCID50/20 g)剂量组。分别于EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d称重,眼眶采血后,断颈处... 目的:建立EMCV感染昆明小鼠模型。方法:6~8周龄昆明小鼠,雌雄各半,分为空白对照组和EMCV高(100TCID50/20 g)、中(10 TCID_(50)/20 g)、低(1 TCID50/20 g)剂量组。分别于EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d称重,眼眶采血后,断颈处死。取心、脑、肝和脾组织,计算各器官脏器指数;qRT-PCR检测心、脑、脾、肝和外周血病毒载量;qRT-PCR检测心和脑IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达量;取心和脑,HE染色后观察组织病理损伤。结果:与空白对照组相比,高剂量的EMCV感染小鼠5 d时,能显著提高心脏指数(P<0.05)和极显著提高脾脏指数(P<0.01);qRT-PCR结果显示EMCV感染9 d时,小鼠心、脑、肝、脾和外周血病毒载量最高,中、低剂量EMCV感染小鼠各脏器中的病毒载量很低;高剂量的EMCV感染小鼠9 d时,心和脑IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.001)和TNF-α(P<0.01)极显著升高;9 d时,高剂量EMCV引起心脏组织炎症细胞浸润和空泡化病变;5~9 d时,高剂量EMCV引起脑组织脑膜增厚、脑膜下血管扩张和出血、脑白质血管扩张形成血管套。结论:EMCV攻毒剂量为0.2 ml 100 TCID_(50)/20 g时,成功建立EMCV感染昆明小鼠模型。 展开更多

关键词 脑心肌炎病毒 昆明小鼠 动物模型

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