目的分析CCDC115(Coiled-Coil Domain-Containing Protein 115)的蛋白性质,利用Ccdc115基因缺失的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),探究CCDC115对胞内鼠伤寒沙门菌生存的影响,为开展CCDC115功能研究及调控胞内沙门菌生存的机制研...目的分析CCDC115(Coiled-Coil Domain-Containing Protein 115)的蛋白性质,利用Ccdc115基因缺失的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),探究CCDC115对胞内鼠伤寒沙门菌生存的影响,为开展CCDC115功能研究及调控胞内沙门菌生存的机制研究提供理论基础。方法采用生物信息学分析,对CCDC115的基本性质进行探究。依据CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RAW264.7-Ccdc115-KO细胞系。将鼠伤寒沙门菌感染RAW264.7及RAW264.7-Ccdc115-KO细胞,通过RT-qRCR、Western Blot、CFU(Colony-Forming Units)计数、酸化成像研究CCDC115在鼠伤寒沙门菌胞内生存中的作用。结果CCDC115是由2个α螺旋及中间无序区组成的不稳定蛋白,无跨膜结构域。成功构建敲除Ccdc115基因的RAW264.7细胞系。鼠伤寒沙门菌感染细胞后,在RAW264.7细胞中mRNA水平和蛋白水平CCDC115表达增加,并且在RAW264.7-Ccdc115-KO细胞内增殖数量是RAW264.7细胞的1.5倍。在吞噬体酸化成像中,鼠伤寒沙门菌吞噬体在RAW264.7细胞中发生酸化,而在RAW264.7-Ccdc115-KO细胞中没有发生酸化。结论成功构建RAW264.7-Ccdc115-KO细胞系;CCDC115在鼠伤寒沙门菌感染过程中表达增加,并可能通过使吞噬体发生酸化抑制鼠伤寒沙门菌在细胞内生存。展开更多
CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)系统具有高效、简单、易编辑等特性,在基因工程方面具有巨大潜能。在果蝇(Drosophila melanogaster)基因功能研究中,CRIS...CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)系统具有高效、简单、易编辑等特性,在基因工程方面具有巨大潜能。在果蝇(Drosophila melanogaster)基因功能研究中,CRISPR/Cas9系统也得到了广泛应用。然而利用传统的CRISPR/Cas9系统编辑果蝇基因时,Cas9与sgRNA表达元件往往分别存在于不同果蝇中,需要通过复杂的遗传杂交过程将Cas9与sgRNA整合到一个个体中,操作周期长且较为复杂。本研究在CRISPR/Cas9系统基础上引入tRNA-sgRNA系统和triplex元件,利用triplex元件连接Cas9和tRNA-sgRNA基因,稳定单转录本切割后Cas9 mRNA的末端,实现一个转录本可以同时表达Cas9蛋白和sgRNA,通过一次杂交即可得到相应表型的后代,简化了遗传操作过程。本研究利用这一新的条件性基因编辑系统,分别对果蝇眼部white(w)基因和翅成虫盘broad(br)基因进行条件性敲除,观察到与预期相符的对应表型。因此,该条件性基因编辑系统在高效性、可扩展性和易操作性等方面是对现有CRISPR/Cas9系统进行的重大改进。展开更多
文摘CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)系统具有高效、简单、易编辑等特性,在基因工程方面具有巨大潜能。在果蝇(Drosophila melanogaster)基因功能研究中,CRISPR/Cas9系统也得到了广泛应用。然而利用传统的CRISPR/Cas9系统编辑果蝇基因时,Cas9与sgRNA表达元件往往分别存在于不同果蝇中,需要通过复杂的遗传杂交过程将Cas9与sgRNA整合到一个个体中,操作周期长且较为复杂。本研究在CRISPR/Cas9系统基础上引入tRNA-sgRNA系统和triplex元件,利用triplex元件连接Cas9和tRNA-sgRNA基因,稳定单转录本切割后Cas9 mRNA的末端,实现一个转录本可以同时表达Cas9蛋白和sgRNA,通过一次杂交即可得到相应表型的后代,简化了遗传操作过程。本研究利用这一新的条件性基因编辑系统,分别对果蝇眼部white(w)基因和翅成虫盘broad(br)基因进行条件性敲除,观察到与预期相符的对应表型。因此,该条件性基因编辑系统在高效性、可扩展性和易操作性等方面是对现有CRISPR/Cas9系统进行的重大改进。
