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大肠杆菌中海藻糖多酶催化体系的构建与优化
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作者 刘琦 李阳阳 +6 位作者 赵伟 赵钰涵 徐显皓 李江华 堵国成 吕雪芹 刘龙 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第20期196-206,共11页
海藻糖是一种无色无味,性质稳定的天然双糖,具有保湿、抗辐射和保护生物分子结构的重要作用,其主要通过双酶法催化生产,但转化率较低。该研究成功构建麦芽寡糖基海藻糖合酶(maltooligosyltrehalose synthase,MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖... 海藻糖是一种无色无味,性质稳定的天然双糖,具有保湿、抗辐射和保护生物分子结构的重要作用,其主要通过双酶法催化生产,但转化率较低。该研究成功构建麦芽寡糖基海藻糖合酶(maltooligosyltrehalose synthase,MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyltrehalose trehalohydrolase,MTHase)以及4-α葡糖基转移酶(4-α-glucanotransferase,4αGT)的大肠杆菌表达系统,从而构建三酶法催化体系,并通过系统优化实现了海藻糖转化率的显著提升。首先,将麦芽寡糖基合酶MTSase、麦芽寡糖基水解酶MTHase以及4-α葡糖基转移酶4αGT整合至pBAD载体中,并在大肠杆菌TR07实现可溶性表达。为进一步提升表达水平,利用生物信息学工具对序列进行优化,获得表达MTSase的重组菌株TR07-1*和表达4αGT的重组菌株TR07-3*,酶活力相较于序列优化前分别提高了87%和52.8%。同时,将6种蛋白促融标签(谷胱甘肽巯基转移酶、麦芽糖结合蛋白、大肠杆菌转录延长的抗终止因子蛋白、蛋白质二硫键异构酶、小泛素样修饰蛋白和硫氧还蛋白)融合于酶的N端,并结合发酵诱导温度、诱导剂浓度和诱导时OD 600值的优化,使MTSase和MTHase的酶活力相较初始条件分别提高了31.9%和15.2%。最终,将优化后的重组大肠杆菌应用到海藻糖的转化中,使转化率由78.65%提升至83.33%。该研究对海藻糖工业化生产具有借鉴意义。 展开更多
关键词 海藻糖酶 大肠杆菌 序列优化 融合表达 海藻糖转化
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生物转化玉米浆生产生物菌肥的共生发酵特性 被引量:5
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作者 任晓洁 班恒 +4 位作者 贺壮壮 王晓龙 赵玉斌 宋元达 赵新河 《农业工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第17期205-213,共9页
玉米深加工是全球第二大宗农产品加工行业,玉米淀粉制备过程中产生大量的副产物,如玉米浆(Maize Steep Liquor,MSL)。玉米浆色深味重、毒素含量高、处理困难,已经成为众多玉米深加工企业发展的桎梏。该研究主要利用玉米浆中丰富的速效... 玉米深加工是全球第二大宗农产品加工行业,玉米淀粉制备过程中产生大量的副产物,如玉米浆(Maize Steep Liquor,MSL)。玉米浆色深味重、毒素含量高、处理困难,已经成为众多玉米深加工企业发展的桎梏。该研究主要利用玉米浆中丰富的速效氮源和微生物的促生长因子进行微生物菌肥的开发。通过对前期筛选到的3株植物根际促生菌(PGPMs)的共生发酵研究,评估了3种菌在玉米浆中高密度发酵的可行性,并对发酵特性进行了研究。试验结果表明,3种菌通过共生发酵,并在模拟流加工业废料结晶糖母液作为补料时,发酵体系中的总生物量从6.6×10~9提升到了2.17×1010CFU/m L,并在52 h氨基酸态氮含量达到最大。同时,采用葡萄糖模拟结晶葡萄糖母液流加补料显著提高了共生体系的总糖以及溶磷的利用率,可溶性磷利用率提高了近50%;此外,添加葡萄糖还能保持发酵体系的p H值稳定,奠定了生产稳定性。该研究为玉米浆的再利用提供了一种解决方法,对低成本生物肥料的开发与生产提供了一种新的思路。 展开更多
关键词 发酵 玉米浆 生物菌肥 根际促生菌 微生态
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半理性设计提升4-α-糖基转移酶歧化活性并应用于工业生产
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作者 谢静雯 李超慧 +2 位作者 韦猛 赵伟 张金祥 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第23期45-52,共8页
4-α-糖基转移酶(4-alpha-glucanotransferase,4αGT)是一种多功能的糖基转移酶,在淀粉工业上具有广泛的应用,如淀粉改性及海藻糖、麦芽寡糖、大环糊精、糖原等淀粉深加工产品的制备。其中,以淀粉为原料制备海藻糖的工业生产过程中,借助... 4-α-糖基转移酶(4-alpha-glucanotransferase,4αGT)是一种多功能的糖基转移酶,在淀粉工业上具有广泛的应用,如淀粉改性及海藻糖、麦芽寡糖、大环糊精、糖原等淀粉深加工产品的制备。其中,以淀粉为原料制备海藻糖的工业生产过程中,借助4αGT的歧化活性,能够减少葡萄糖、麦芽糖等副产物的含量,从而提升海藻糖产量。在该研究中,采用半理性设计策略对Synechocystis sp.PCC 6803来源4αGT进行了改造。研究基于HotSpot Wizard在线工具及残基所处空间位置选择突变热点,利用4-α-糖基转移酶水解淀粉产生透明圈的能力对18000个转化子进行高通量筛选,确定了一个对4αGT酶活性起着关键性作用的位点,对其进行饱和突变,最终获得活性提升的突变体A470F,歧化活性较野生型提升了17%。在工业化生产的条件下,突变体A470F在海藻糖制备上,较野生型也有所提升。通过对突变位点附近底物通道及作用力进行分析,为4αGT的活性改造提供了理论支持,并且为淀粉糖工业的制造效率提升提供了新思路。 展开更多
关键词 海藻糖 4-α-糖基转移酶 半理性设计 歧化活性
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黑曲霉葡萄糖吸收定量检测的方法建立及其在MstC功能研究中的应用
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作者 高凯月 郭雨婷 +5 位作者 杜奕谋 郑小梅 马欣荣 赵伟 郑平 孙际宾 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期71-80,共10页
黑曲霉是有机酸与酶制剂重要的工业生产菌株,具有强大的水解酶系与葡萄糖转运系统,可快速响应胞外碳源变化,摄取环境中葡萄糖供给细胞生长和产物合成。作为重要的碳源底物与关键的信号分子,葡萄糖的摄取吸收直接影响黑曲霉细胞生长与发... 黑曲霉是有机酸与酶制剂重要的工业生产菌株,具有强大的水解酶系与葡萄糖转运系统,可快速响应胞外碳源变化,摄取环境中葡萄糖供给细胞生长和产物合成。作为重要的碳源底物与关键的信号分子,葡萄糖的摄取吸收直接影响黑曲霉细胞生长与发酵性能。针对目前丝状真菌缺乏简便葡萄糖吸收能力定量表征方法的问题,本文以2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)作为葡萄糖吸收探针,通过将预培养的黑曲霉孢子与2-NBDG孵育后,利用荧光显微成像与流式细胞分析,建立了丝状真菌的葡萄糖吸收的定量检测方法。结果发现,2-NBDG的最佳使用浓度为150μmol/L,最佳孵育时间为4 h。进一步利用该定量分析方法,发现低亲和力葡萄糖转运蛋白MstC的过表达使黑曲霉葡萄糖吸收提高1.44倍,同时在前期研究的基础上,利用多序列比对分析,设计了MstC的突变体R188K,通过检测发现该点突变可直接导致MstC葡萄糖转运活性的丧失,这表明Arg188是影响MstC葡萄糖转运能力的关键氨基酸位点。本文葡萄糖摄取定量检测方法的建立及其在MstC功能研究上的应用,不仅加深了丝状真菌葡萄糖吸收的定量认识,也为葡萄糖转运系统的改造优化提供了技术支撑。 展开更多
关键词 黑曲霉 葡萄糖吸收 2-NBDG 葡萄糖转运蛋白 MstC 荧光成像 流式细胞检测
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