大肠杆菌otsB基因的克隆与转化本生烟草的初步研究 被引量：3

1

作者 陆玉建 张韩杰 +2 位作者 刘南南 韩文瑜 沈志强 《广东农业科学》 CAS 2015年第8期108-112,193,共5页

海藻糖是一种非还原糖类,可作为渗透调节剂,提高生物在非生物胁迫条件下的抗逆能力。6-磷酸海藻糖磷酸化酶(TPP)是海藻糖生物合成中的重要酶类,在大肠杆菌中,ots B基因编码TPP。以大肠杆菌的基因组DNA为模板,通过菌落PCR技术克隆得到ot... 海藻糖是一种非还原糖类,可作为渗透调节剂,提高生物在非生物胁迫条件下的抗逆能力。6-磷酸海藻糖磷酸化酶(TPP)是海藻糖生物合成中的重要酶类,在大肠杆菌中,ots B基因编码TPP。以大肠杆菌的基因组DNA为模板,通过菌落PCR技术克隆得到ots B基因。将目的基因和p2300-GFP相连,从而构建p2300-ots BGFP表达载体。利用根癌农杆菌介导的叶盘法转化本生烟草,将ots B导入到受体细胞中。通过组织培养和抗生素筛选,初步获得具有抗性的转基因本生烟草。 展开更多

关键词 海藻糖 otsB基因 表达载体 本生烟草 根癌农杆菌

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农杆菌介导rd29A启动子驱动otsB基因转化紫茉莉的研究 被引量：2

2

作者 陆玉建 张韩杰 +1 位作者 韩文瑜 沈志强 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期401-408,共8页

紫茉莉为紫茉莉科紫茉莉属多年生草本植物,具有较高观赏和药用价值,对重金属和石油污染有较强修复能力。然而目前为止,紫茉莉再生和遗传转化体系尚未建立。本研究以紫茉莉为材料,初步建立起较为稳定的再生体系。通过克隆拟南芥rd29A启... 紫茉莉为紫茉莉科紫茉莉属多年生草本植物,具有较高观赏和药用价值,对重金属和石油污染有较强修复能力。然而目前为止,紫茉莉再生和遗传转化体系尚未建立。本研究以紫茉莉为材料,初步建立起较为稳定的再生体系。通过克隆拟南芥rd29A启动子和大肠杆菌ots B基因,构建了p2300-rd29A pro-ots B植物表达载体。利用根癌农杆菌介导法对紫茉莉进行遗传转化。结果表明,当农杆菌的OD600=0.5,侵染成熟胚或带芽茎段60 min,共培养2 d,紫茉莉的转化效率较高。通过对筛选出的转基因植株进行PCR检测,显示大肠杆菌ots B基因已成功整合到紫茉莉的基因组中,并可有效的进行转录。 展开更多

关键词 紫茉莉 RD29A启动子 otsB基因 农杆菌 遗传转化

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蜂胶提取物饲料添加剂的免疫调节作用研究 被引量：2

3

作者 郭振环 马霞 +3 位作者 刘永录 程立坤 王恬 沈志强 《饲料研究》 CAS 2016年第3期26-28,共3页

试验研究蜂胶提取物对肉鸡的免疫调节作用。AA肉鸡在免疫的同时,在饲料中添加0.1‰、0.2‰和0.4‰的蜂胶提取物5 d。于14(D_(14))、21(D_(21))、28(D_(28))、35(D_(35))和42(D_(42))日龄采血,采用β-微量法测定新城疫和流感特异性抗体,1... 试验研究蜂胶提取物对肉鸡的免疫调节作用。AA肉鸡在免疫的同时,在饲料中添加0.1‰、0.2‰和0.4‰的蜂胶提取物5 d。于14(D_(14))、21(D_(21))、28(D_(28))、35(D_(35))和42(D_(42))日龄采血,采用β-微量法测定新城疫和流感特异性抗体,14(D_(14))和28(D_(28))日龄采用ELISA方法测定血清免疫球蛋白G(IgG)、白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)含量。结果显示,0.2‰和0.4‰剂量蜂胶提取物可明显提高肉鸡血清ND和AI特异性抗体、血清IgG、IL-2和IFN-γ含量。蜂胶提取物就有很好的增强免疫作用,是一种很好调节免疫的饲料天然产物添加剂。 展开更多

关键词 蜂胶提取物 肉鸡 饲料添加剂 增强免疫

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大肠杆菌otsAB融合基因表达载体的构建和转化小麦的初步研究

4

作者 陆玉建 石东里 +3 位作者 张兰 田莎 张韩杰 刘南南 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2015年第S1期1-7,共7页

在生物或非生物胁迫的条件下,小麦的产量和质量常会受到一定的影响。基因工程技术是小麦品质改良的有效手段,但目前小麦的转化效率还比较低。通过克隆大肠杆菌ots A和ots B基因,将目的基因和p2300-GFP相连,成功构建p2300-ots AB表达载... 在生物或非生物胁迫的条件下,小麦的产量和质量常会受到一定的影响。基因工程技术是小麦品质改良的有效手段,但目前小麦的转化效率还比较低。通过克隆大肠杆菌ots A和ots B基因,将目的基因和p2300-GFP相连,成功构建p2300-ots AB表达载体。以普通小麦品种为材料,在建立较完善再生体系的基础上,利用根癌农杆菌介导法进行转化,将ots AB导入到受体细胞,进而获得耐盐的转基因小麦新品种。遗传转化条件的优化结果表明,当农杆菌的OD600=0.5,侵染成熟胚或愈伤组织的时间为30 min,共培养时间为3 d,小麦的转化效率最高。结果可以为今后通过基因工程技术提高小麦的抗逆能力提供参考。 展开更多

关键词 小麦 otsA otsB 成熟胚 愈伤组织 农杆菌

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蜂胶提取物饲料添加剂的抗氧化作用研究

5

作者 郭振环 马霞 +3 位作者 程立坤 刘永录 王恬 沈志强 《饲料研究》 CAS 2016年第1期22-24,共3页

试验研究蜂胶提取物的制备工艺及其作为饲料添加剂对肉鸡抗氧化作用的影响。采用乙醇提取,喷雾干燥制备蜂胶提取物,30日龄肉鸡连续混饲0.1‰、0.2‰、0.4‰和0.8‰的蜂胶提取物5 d,于40日龄采血测定血浆及肝组织中丙二醛(MDA)、过氧化氢... 试验研究蜂胶提取物的制备工艺及其作为饲料添加剂对肉鸡抗氧化作用的影响。采用乙醇提取,喷雾干燥制备蜂胶提取物,30日龄肉鸡连续混饲0.1‰、0.2‰、0.4‰和0.8‰的蜂胶提取物5 d,于40日龄采血测定血浆及肝组织中丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)和超氧化物歧化酶(SOD)含量。结果显示,0.4‰和0.8‰剂量蜂胶提取物可显著提高肉鸡的SOD含量(P<0.05),降低MDA和CAT含量,结果表明蜂胶提取物可提高肉鸡抗氧化功能,且以0.4‰和0.8‰添加量效果较好。 展开更多

关键词 蜂胶提取物 肉鸡 饲料添加剂 抗氧化

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猪链球菌Ide通用截短蛋白原核表达及纯化研究

6

作者 曲光刚 王长江 +5 位作者 李书光 李茂峰 武曰星 金婷婷 韩文瑜 沈志强 《中国兽药杂志》 2018年第6期7-12,共6页

为利用大肠埃希菌表达猪链球菌Ide通用截短蛋白,通过对Gen Bank公布的Ide S蛋白家族基因同源性分析,使用Primer 5.0软件设计一对特异性引物,以猪链球菌2型强毒株JZLQ全基因组为模板,采用PCR方法扩增Ide基因截短片段,经Bam HⅠ和HindⅢ... 为利用大肠埃希菌表达猪链球菌Ide通用截短蛋白,通过对Gen Bank公布的Ide S蛋白家族基因同源性分析,使用Primer 5.0软件设计一对特异性引物,以猪链球菌2型强毒株JZLQ全基因组为模板,采用PCR方法扩增Ide基因截短片段,经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后将目的片段分别克隆到p ET28a、p ET32a和p ET-sumo表达载体上,分别转化宿主菌E.coli BL21(DE3)。通过优化诱导温度及诱导剂IPTG浓度进行表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析。结果显示,PCR扩增片段大小约为1200 bp,经双酶切和测序验证构建正确;三种重组表达载体转化大肠埃希菌后均有目的蛋白表达,但不同表达条件下目的蛋白表达量存在差异,其中p ET28a-Tr Ide重组表达载体用25℃诱导、IPTG终浓度为1 mmol/L时可实现重组蛋白的高效可溶性表达,为IdeSsuis蛋白在猪链球菌通用疫苗研发方面的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪链球菌2型 IgM裂解酶 原核表达 SDS-PAGE分析

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AtHKT1启动子转化本生烟草的初步研究 被引量：2

7

作者 陆玉建 李震 +5 位作者 张弘扬 姜翠凤 郝舒蕾 林建辉 张永磊 吴涛 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2018年第A01期10-16,共7页

HKT蛋白家族主要参与控制K+的吸收和K+/Na+的选择性运输,对提高植物抗胁迫能力具有重要的作用。为了研究At HKT1组织表达水平与植物耐盐性的关系,利用生物信息学技术对HKT类蛋白的同源性、At HKT1基因表达情况及其启动子顺式作用元件进... HKT蛋白家族主要参与控制K+的吸收和K+/Na+的选择性运输,对提高植物抗胁迫能力具有重要的作用。为了研究At HKT1组织表达水平与植物耐盐性的关系,利用生物信息学技术对HKT类蛋白的同源性、At HKT1基因表达情况及其启动子顺式作用元件进行分析和预测,在此基础上将At HKT1启动子导入到本生烟草细胞中,根据GUS染色结果,分析At HKT1基因在本生烟草中的组织表达水平。生物信息学分析结果显示,拟南芥和小麦处于不同的进化分支,亲缘关系较远,提示At HKT1的功能可能与小麦中相应蛋白存在一定的差异。At HKT1基因在拟南芥许多器官和组织中都有丰富的表达,其中在叶、根和花中的表达量较高,证实At HKT1基因可能具有重要的生理功能。At HKT1启动子可能是一个逆境响应启动子,包含多种能够响应环境胁迫的重要元件。因此,At HKT1基因表达很可能受到环境胁迫的调控。GUS染色结果显示,转pHKT1-gus本生烟草幼苗叶、维管系统、根以及花的染色较深,进一步证实At HKT1在这些区域表达量较高。以上结果表明,At HKT1基因表达调控有利于实现Na+的转运,进而调节植物耐盐性。除此之外,还可能有其他一些未知的功能,这进一步增加了At HKT1功能的复杂性。目前,有关HKT类蛋白K+和Na+转运方式的机制并不明确,通过分析At HKT1基因在本生烟草中的表达水平,为进一步了解At HKT1基因的作用机制提供参考。 展开更多

关键词 AtHKT1基因 本生烟草 启动子 表达水平 GUS染色

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紫茉莉不定芽诱导和植株再生 被引量：5

8

作者 陆玉建 张韩杰 +1 位作者 韩文瑜 沈志强 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1439-1444,共6页

紫茉莉(Mirabilis jalapa)观赏价值较高,是一种重要的污染修复植物。组织培养技术为植物品种改良和选育的重要途径,但紫茉莉离体快繁方面的研究尚未见有相关报道。该研究以紫茉莉叶片和茎段为外植体,通过观察和统计外植体愈伤组织和不... 紫茉莉(Mirabilis jalapa)观赏价值较高,是一种重要的污染修复植物。组织培养技术为植物品种改良和选育的重要途径,但紫茉莉离体快繁方面的研究尚未见有相关报道。该研究以紫茉莉叶片和茎段为外植体,通过观察和统计外植体愈伤组织和不定芽的诱导情况,分析不同植物生长物质对紫茉莉植株再生的影响。结果表明:紫茉莉带芽茎段比较适合丛生芽的诱导,当带芽茎段在MS+1.0 mg·L^(-1)6-BA+1.5 mg·L^(-1)KT+1.0 mg·L^(-1)NAA+0.05 mg·L^(-1)TDZ培养基中培养时,不定芽的增殖系数较高。无论是MS或1/2MS培养基,都可诱导不定根的产生,其中生根效果较好的培养基为1/2 MS+0.5 mg·L^(-1)NAA。该研究结果探索了紫茉莉组织培养的最适条件,根据愈伤组织诱导率和不定芽的增殖系数筛选出了适宜不定芽诱导的培养基类型,根据不定芽生根情况确定了最佳的生根诱导培养基,为建立紫茉莉高效稳定的再生和遗传转化体系奠定了基础。 展开更多

关键词 紫茉莉 茎段 不定芽 诱导 再生

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蜂胶黄酮对宿主细胞抗病毒能力的影响 被引量：9

9

作者 郭振环 马霞 +1 位作者 王恬 沈志强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第8期2190-2195,共6页

本试验旨在研究蜂胶黄酮对宿主细胞抗病毒能力的影响。首先采用MTT法测定蜂胶黄酮对宿主鸡胚成纤维细胞(CEF)和PK-15细胞的安全浓度;然后将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg/mL开始倍比稀释至15.6μg/mL共5个浓度,将蜂胶黄酮分别与新城疫病... 本试验旨在研究蜂胶黄酮对宿主细胞抗病毒能力的影响。首先采用MTT法测定蜂胶黄酮对宿主鸡胚成纤维细胞(CEF)和PK-15细胞的安全浓度;然后将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg/mL开始倍比稀释至15.6μg/mL共5个浓度,将蜂胶黄酮分别与新城疫病毒(NDV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及猪细小病毒(PPV)一起加到相应长成单层的宿主细胞CEF或PK-15中,在感染后24、48和72h分别用MTT法测定宿主细胞的存活率,代表蜂胶黄酮提高宿主细胞抗病毒能力的指标。结果显示,蜂胶黄酮可显著提高宿主细胞抗病毒能力,这种活性与其剂量正相关,即剂量越大作用越好。蜂胶黄酮提高宿主细胞抗有囊膜病毒NDV和TGEV作用主要体现在病毒感染的前期,而提高宿主细胞抗无囊膜病毒IBDV和PPV作用主要体现在病毒感染的后期。提示蜂胶黄酮可用于NDV和TGEV的预防及IBDV和PPV的治疗。 展开更多

关键词 蜂胶黄酮 宿主细胞 抗病毒

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小麦愈伤组织的诱导和再生体系的建立 被引量：2

10

作者 陆玉建 王书平 +2 位作者 王宁宁 刘俊华 高春明 《江苏农业科学》 北大核心 2016年第9期67-70,共4页

以普通小麦的成熟胚为试验材料,研究不同激素组合对小麦愈伤组织诱导和植株再生的影响。结果表明,小麦愈伤组织诱导效果最好的培养基为W5[MS+0.5 g/L水解络蛋白(CH)+2.0 mg/L 2,4-D+0.15 g/L天冬酰胺(Asn)],在此培养基中,成熟胚产生的... 以普通小麦的成熟胚为试验材料,研究不同激素组合对小麦愈伤组织诱导和植株再生的影响。结果表明,小麦愈伤组织诱导效果最好的培养基为W5[MS+0.5 g/L水解络蛋白(CH)+2.0 mg/L 2,4-D+0.15 g/L天冬酰胺(Asn)],在此培养基中,成熟胚产生的愈伤组织质量最好,诱导率最高。对于不定芽诱导,最适培养基为WF8(MS+0.5 g/L CH+4.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA),在此培养基中,愈伤组织分化产生的不定芽数量最多,速度最快,分化率最高。比较适宜诱导生根的培养基为WR4(1/2MS+0.5 g/L CH+0.5 mg/L NAA),在此培养基中,不定芽生根速度最快,数量最多,并且较为粗壮。本试验旨在探索小麦组织培养的最适条件,为今后通过基因工程手段改良小麦的品质奠定基础。 展开更多

关键词 小麦 成熟胚 愈伤组织 不定芽 再生体系

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SPF鸡胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK细胞中的表达 被引量：1

11

作者 陆玉建 吴信明 +4 位作者 管宇 张松林 李树芳 韩文瑜 沈志强 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2016年第2期45-51,共7页

为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3ga... 为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3galⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染MDCK细胞,在G418的筛选下,获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和PCR检测,筛选可稳定表达St3galⅠ基因的细胞株。结果表明,从鸡胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo质粒,从而实现真核表达载体pCI-neo-St3galⅠ的构建。在G418选择压力下,初步获得了稳转目的基因的MDCK细胞系。将抗性细胞混合克隆进行稀释,经选择后挑选出30个单克隆抗性细胞株。分别以转染细胞基因组DNA和总RNA为模板,经PCR检测显示,目的基因已整合入MDCK细胞的基因组中并可稳定的进行表达。 展开更多

关键词 唾液酸 St3galⅠ基因 MDCK 转染 G418 PCR

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蜂胶黄酮对病毒诱导PK-15细胞凋亡的影响 被引量：1

12

作者 郭振环 马霞 +2 位作者 王文秀 王恬 沈志强 《动物医学进展》 北大核心 2016年第8期41-44,共4页

为研究蜂胶黄酮对病毒诱导宿主细胞凋亡的影响,将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg/mL倍比稀释5个浓度,与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪细小病毒(PPV)分别一起加至单层PK-15细胞培养体系中,用流式细胞仪检测蜂胶黄酮对TGEV和PPV感染PK-15... 为研究蜂胶黄酮对病毒诱导宿主细胞凋亡的影响,将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg/mL倍比稀释5个浓度,与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪细小病毒(PPV)分别一起加至单层PK-15细胞培养体系中,用流式细胞仪检测蜂胶黄酮对TGEV和PPV感染PK-15细胞凋亡率的影响。结果显示,与病毒对照组比较,TGEV和PPV感染PK-15细胞后,蜂胶黄酮可以显著降低PPV感染引起的PK-15细胞凋亡率,而对TGEV感染引起的PK-15细胞凋亡率则没有显著影响。说明蜂胶黄酮可以减轻无囊膜的PPV感染对PK-15细胞引起的凋亡。 展开更多

关键词 蜂胶黄酮 猪传染性胃肠炎病毒 猪细小病毒 细胞凋亡

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新城疫病毒F基因的克隆表达及重组蛋白的反应原性分析 被引量：1

13

作者 曲光刚 李佃场 +5 位作者 李茂峰 金婷婷 武曰星 王长江 刘博 高三阳 《中国兽药杂志》 北大核心 2015年第9期7-10,共4页

为分析新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)及其突变体(Fm)基因的反应原性,以携带有NDV-F和NDV-Fm基因的质粒为模板设计引物,PCR扩增产物经双酶切后分别连入原核表达载体pET-SUMO、pET-28a,构建重组质粒pET-SUMO-F、pET-28a-Fm,将重组质粒转化... 为分析新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)及其突变体(Fm)基因的反应原性,以携带有NDV-F和NDV-Fm基因的质粒为模板设计引物,PCR扩增产物经双酶切后分别连入原核表达载体pET-SUMO、pET-28a,构建重组质粒pET-SUMO-F、pET-28a-Fm,将重组质粒转化入宿主菌Rosetta 2感受态细胞,在IPTG诱导下表达。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,NDV-F和NDV-Fm在原核系统中表达后分别获得了相对分子量为64.7 kD和48.7 kD的重组蛋白;重组蛋白能被抗NDV鸡阳性血清识别。试验表明,NDV-F和NDV-Fm可以在原核系统中表达,且具有良好的反应原性。 展开更多

关键词 新城疫病毒 F蛋白 原核表达 反应原性

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K亚群禽白血病病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用 被引量：1

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作者 徐晴晴 王峰 +2 位作者 王文秀 莫玲 沈志强 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期113-119,共7页

为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性... 为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和符合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合性。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h左右可对ALV-K进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。 展开更多

关键词 K亚群禽白血病病毒 RPA crRNA CRISPR/Cas13a

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