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狂犬病诊断基因芯片的建立和检测应用的初步研究 被引量:10
1
作者 张伟 吴时友 +2 位作者 尹燕博 牛钟相 张秀美 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期132-135,共4页
根据已发表的狂犬病病毒(RV)的序列,设计合成能扩增高度保守核(N)蛋白片断的一对引物。通过生物素标记PCR技术,将核(N)蛋白基因片断作为探针点在硝酸素纤维膜上,制作成疾病诊断基因芯片。取160份可疑动物的血液,提取核酸作模板进行PCR扩... 根据已发表的狂犬病病毒(RV)的序列,设计合成能扩增高度保守核(N)蛋白片断的一对引物。通过生物素标记PCR技术,将核(N)蛋白基因片断作为探针点在硝酸素纤维膜上,制作成疾病诊断基因芯片。取160份可疑动物的血液,提取核酸作模板进行PCR扩增,将其产物与诊断基因芯片进行特异性逆向点杂交检测;并用蔗糖密度梯度离心和凝胶层析纯化狂犬病病毒作抗原,建立检测RV抗体的间接ELISA。把以上两种方法应用于临床,结果基因芯片的检测率比ELISA方法和(RT)PCR要高15%左右,表明建立的狂犬病诊断基因芯片具有更高的灵敏度和特异性。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 基因芯片 间接ELISA (RT)PCR
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细菌通用引物在奶牛乳房炎病原菌检测中的作用研究 被引量:6
2
作者 李秀萍 尹逊河 +1 位作者 吴时友 尹燕博 《动物医学进展》 CSCD 2005年第4期104-106,共3页
为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,探索通用引物在奶牛乳房炎致病菌检测中的应用价值。利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增标准菌株及患有奶牛乳房炎的奶样。结果表明,通用引物扩增7... 为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,探索通用引物在奶牛乳房炎致病菌检测中的应用价值。利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增标准菌株及患有奶牛乳房炎的奶样。结果表明,通用引物扩增7 种标准菌株,370 bp处均可得到清晰的电泳条带;通用引物PCR 可检出250 ng/L的金黄色葡萄球菌标准菌株DNA;对患有奶牛乳房炎的奶样进行扩增,370 bp处也得到了清晰的电泳条带。建立在16S rRNA基础上的通用引物在奶牛乳房炎的检测中,初步显示具有特异、快速等优点,为进一步判断细菌的种类奠定了基础。 展开更多
关键词 通用引物 聚合酶链反应 乳房炎
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狂犬病病毒低密度基因芯片的建立及其与常规检测方法的比较研究 被引量:3
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作者 张伟 吴时友 +1 位作者 尹燕博 张秀美 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2007年第2期139-141,共3页
根据已发表狂犬病病毒(RV)的序列,设计合成扩增高度保守核(N)蛋白片断的引物。通过生物素标记的RT-PCR技术和微量点样技术,将高度保守N蛋白基因片段作为探针点,在硝酸纤维素膜上制成16点阵的低密度诊断基因芯片。提取160份可疑犬的血液... 根据已发表狂犬病病毒(RV)的序列,设计合成扩增高度保守核(N)蛋白片断的引物。通过生物素标记的RT-PCR技术和微量点样技术,将高度保守N蛋白基因片段作为探针点,在硝酸纤维素膜上制成16点阵的低密度诊断基因芯片。提取160份可疑犬的血液,以核酸作模板进行RT-PCR扩增,将其产物分别用琼脂糖凝胶电泳和低密度芯片检测;同时采用蔗糖密度梯度离心和凝胶层析纯化狂犬病病毒作抗原,建立间接ELISA的检测方法。试验结果表明,RV低密度基因芯片的检测率比ELISA方法和RT-PCR方法灵敏度高、特异性强,完全可以作为临床诊断的一种方法。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 基因芯片 间接ELISA PCR
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鸡新城疫病毒荧光双链引物实时荧光PCR检测方法的研究 被引量:2
4
作者 李军 吴时友 +1 位作者 尹燕博 牛钟相 《家畜生态学报》 2006年第4期89-93,共5页
根据鸡新城疫F糖蛋白的保守基因序列,设计一对正引物。根据正引物设计一对与之相互补的负引物。正引物的5’端标记FAM,负引物的3’标记淬灭剂DABCYL。反应体系中进行引物杂交后,由于正、负引物完全互补,FAM产生的荧光被标记在负引物上的... 根据鸡新城疫F糖蛋白的保守基因序列,设计一对正引物。根据正引物设计一对与之相互补的负引物。正引物的5’端标记FAM,负引物的3’标记淬灭剂DABCYL。反应体系中进行引物杂交后,由于正、负引物完全互补,FAM产生的荧光被标记在负引物上的DAB-CYL淬灭掉。然后利用杂交后生成的荧光双引物对鸡新城疫及AIVI、LTVI、BV四种病毒和MG进行了实时荧光PCR检测。结果表明,只有以鸡新城疫标准毒株的克隆质粒为模板的管中能够检测到荧光信号,其他管中没有信号产生。该方法特异性强,灵敏度高,重复性好,在鸡新城疫临床诊断和出入境检疫中有着广阔的应用前景。 展开更多
关键词 鸡新城疫 荧光双链引物 克隆
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五种鸡呼吸道传染病基因芯片诊断技术的研究 被引量:1
5
作者 陈凤梅 吴时友 +1 位作者 尹燕博 牛钟相 《家畜生态学报》 2006年第2期55-58,共4页
用分子克隆方法获得新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒,鸡毒支原体各一段高度保守基因片段作为探针,用芯片点样仪点样到硝酸纤维膜上,制成检测基因芯片;提取样品中的RNA进行反转录,然后在PCR过程中用生... 用分子克隆方法获得新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒,鸡毒支原体各一段高度保守基因片段作为探针,用芯片点样仪点样到硝酸纤维膜上,制成检测基因芯片;提取样品中的RNA进行反转录,然后在PCR过程中用生物素标记,将PCR产物滴加到芯片上进行特异性杂交,对杂交结果进行扫描分析,可同时对上述5种常见禽呼吸道疾病作出诊断。此方法与PCR检测方法结果符合率在95%以上,其检出率比临床分离法要高30%以上。 展开更多
关键词 基因芯片 禽呼吸道疾病 诊断
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实时荧光PCR方法检测禽病毒病的研究 被引量:1
6
作者 田振宇 吴时友 +2 位作者 郑彤彤 尹燕博 牛钟相 《家畜生态学报》 2007年第1期82-85,共4页
通用探针是实时荧光PCR探针类的一种,具有高度的特异性和灵敏度,可对样品进行准确的定量分析。本试验主要采用该方法对通用探针检测禽病毒病进行了研究,试验结果显示本方法的特异性、灵敏度和Taq Man探针相近,且具有操作简便、费用低廉... 通用探针是实时荧光PCR探针类的一种,具有高度的特异性和灵敏度,可对样品进行准确的定量分析。本试验主要采用该方法对通用探针检测禽病毒病进行了研究,试验结果显示本方法的特异性、灵敏度和Taq Man探针相近,且具有操作简便、费用低廉等优点。 展开更多
关键词 实时荧光PCR 通用探针 通用模板
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鸡14种病毒病基因芯片的研究 被引量:7
7
作者 吴时友 尹燕博 +6 位作者 郑彤彤 韩丽敏 田振宇 张巧燕 毛雪松 李青照 史忠华 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2005年第7期27-29,共3页
应用PCR或RT-PCR方法分别获得鸡新城疫(ND)、禽流感(AI)、鸡传染性支气管炎(IB)、鸡传染性法氏囊病(IBD)、鸡传染性喉气管炎(ILT)、鸡马立克氏病(MD)、减蛋综合征(EDS-76)、禽网状内皮组织增生症(RE)、鸡脑脊髓炎(AE)、鸡传染性贫血症(C... 应用PCR或RT-PCR方法分别获得鸡新城疫(ND)、禽流感(AI)、鸡传染性支气管炎(IB)、鸡传染性法氏囊病(IBD)、鸡传染性喉气管炎(ILT)、鸡马立克氏病(MD)、减蛋综合征(EDS-76)、禽网状内皮组织增生症(RE)、鸡脑脊髓炎(AE)、鸡传染性贫血症(CIA)、鸡病毒性关节炎(AVA)、包涵体肝炎(IBH)、禽白血病(AL)、鸡痘(FP)各一特异性片断,以这些片断为探针,采用接触式点样技术,制成低密度的DNA阵列芯片。自病料中提取核酸,通过生物标记技术,使样品核酸标记上生物素。当样品和预点在硝酸纤维素膜上的探针杂交后,通过显色技术,即可得出诊断结果。 展开更多
关键词 基因芯片 病毒病 网状内皮组织增生症 鸡传染性支气管炎 鸡传染性法氏囊病 鸡传染性喉气管炎 鸡病毒性关节炎 鸡马立克氏病 硝酸纤维素膜 PCR方法 减蛋综合征 包涵体肝炎 鸡新城疫 脑脊髓炎 禽白血病 阵列芯片 标记技术
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猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用 被引量:15
8
作者 陈红军 侯义宏 +5 位作者 白华 陈桂来 吴时友 尹燕博 钱永华 田振宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期708-712,共5页
根据流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)亚型基因序列间的差异性,分别设计H1、H3、H9、N1和N2的特异分型引物,并根据M基因设计A型流感病毒的通用引物。RT-PCR扩增猪流感病毒各亚型HA、NA和M基因的特异片段,克隆至pMD18-T构建重组质粒,... 根据流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)亚型基因序列间的差异性,分别设计H1、H3、H9、N1和N2的特异分型引物,并根据M基因设计A型流感病毒的通用引物。RT-PCR扩增猪流感病毒各亚型HA、NA和M基因的特异片段,克隆至pMD18-T构建重组质粒,制备探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。并对217份不同地区的样品进行检测。结果表明:该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒,并显示了较高的灵敏度和特异性,灵敏度比PCR高1个稀释度,比病毒分离高2个稀释度。该方法的建立为猪流感的检测及猪流感病毒各亚型在猪群中的流行病学调查提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。 展开更多
关键词 猪流感病毒 基因芯片 多重PCR 核酸杂交
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猪病毒性繁殖障碍病低密度基因芯片诊断方法的建立 被引量:15
9
作者 高淑霞 吴时友 +2 位作者 庄文忠 尹燕博 牛钟相 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期39-42,共4页
应用PCR(或RT-PCR)分别扩增猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒-2型、日本乙型脑炎病毒和猪瘟病毒的一段保守序列,克隆到pMD 18-T Simple Vector构建重组质粒,用于制备各病毒的探针。将各探针按一定... 应用PCR(或RT-PCR)分别扩增猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒-2型、日本乙型脑炎病毒和猪瘟病毒的一段保守序列,克隆到pMD 18-T Simple Vector构建重组质粒,用于制备各病毒的探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上并加以固定,制备成低密度检测基因芯片。在多重PCR扩增过程中用生物素标记的dUTP(Bio-11-dUTP)对待检样品进行标记,扩增产物与芯片杂交,用扫描仪对杂交结果进行扫描分析。经对68份样品检测结果证明,该方法可以同时检测待检样品中上述6种病毒核酸的存在情况,与PCR方法相比,显示了较高的灵敏度。该方法的建立,为大批量快速诊断、普查猪病毒性繁殖障碍疫病提供了保证。 展开更多
关键词 病毒性繁殖障碍病 基因芯片 多重PCR 核酸杂交
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鸡呼吸道传染病基因芯片诊断方法的建立 被引量:10
10
作者 陈凤梅 吴时友 +1 位作者 尹燕博 牛钟相 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1358-1362,共5页
A microarray technique was developed by preparing highly conserved DNA fragments for five poultry respiratory tract diseases(Newcastle disease virus,avian influenza,infectious bronchitis virus,infectious laryngotrache... A microarray technique was developed by preparing highly conserved DNA fragments for five poultry respiratory tract diseases(Newcastle disease virus,avian influenza,infectious bronchitis virus,infectious laryngotracheitis virus,Mycoplasma gallisepticum)using molecular cloning methods and the DNA fragments were spotted onto NC filter to form microarrays.RNA extracted from samples was reverse-transcripted,then followed by PCR amplification and labling with biotin-11-dUTP.The labeled DNA and prepared DNA microarray were subjected to specific hybridization,the hybridization results were scanned and analyzed with a scanner. The results showed that the microarray technique could identify and distinguish the five poultry respiratory tract diseases.The method is rapid,sensitive and specific,and can screen or quarantine a large number ample samples within a very short time. 展开更多
关键词 基因芯片 生物素 新城疫 禽流感 传染性支气管炎 传染性喉气管炎 鸡毒支原体
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通用基因芯片对奶牛乳房炎主要致病菌的检测 被引量:10
11
作者 李秀萍 尹逊河 +2 位作者 高晨 尹燕博 吴时友 《动物医学进展》 CSCD 2008年第6期19-23,共5页
应用生物信息学手段和查阅文献资料设计了金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、绿脓杆菌、停乳链球菌、乳房链球菌6种奶牛乳房炎主要致病菌的通用引物和金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌的寡核苷酸探针及无乳链球菌、停乳链... 应用生物信息学手段和查阅文献资料设计了金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、绿脓杆菌、停乳链球菌、乳房链球菌6种奶牛乳房炎主要致病菌的通用引物和金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌的寡核苷酸探针及无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌的特异引物,并用这3种特异引物扩增片段的纯化产物作为这3种链球菌的检测探针。在引物对样品中细菌的相应基因片段扩增的同时进行靶基因的生物素标记,扩增的产物与硝酸纤维素膜上的探针进行杂交,酶联、显色后根据芯片扫描仪的判读结果来确定奶牛乳房炎致病菌感染的种类。结果表明,建立的以16S rDNA为对象的基因芯片技术可以快速的检测出以上6种细菌,整个检测过程需要6h^7h,灵敏度高,特异性好,能快速的对奶牛乳房炎的主要致病菌做出诊断。 展开更多
关键词 基因芯片 通用引物 奶牛乳房炎 致病菌
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鸡传染性支气管炎ELISA抗体检测试剂盒的研制 被引量:4
12
作者 王君玮 尹燕博 +4 位作者 刘清河 郭福生 孙淑芳 赵德明 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2004年第3期27-29,共3页
采用加蔗糖垫离心纯化鸡传染性支气管炎病毒(IBV)制备抗原 ,用提纯的IBV抗原包被微量板,建立了检测鸡传染性支气管炎 (IB)抗体的ELISA试剂盒。抗原、被检血清和酶标结合物的最佳工作浓度分别为10ug/ml、1∶200和1∶3200。与IDEXX试剂盒... 采用加蔗糖垫离心纯化鸡传染性支气管炎病毒(IBV)制备抗原 ,用提纯的IBV抗原包被微量板,建立了检测鸡传染性支气管炎 (IB)抗体的ELISA试剂盒。抗原、被检血清和酶标结合物的最佳工作浓度分别为10ug/ml、1∶200和1∶3200。与IDEXX试剂盒相比 ,其敏感性、重复性、特异性均接近国外同类产品水平。对SPF鸡血清、实验免疫与攻毒的SPF鸡血清进行检测 ,结果表明所建立的ELISA特异性为95.6% ,与IDEXX试剂盒符合率为95.6%。用于检测抗IBV特异性IgG抗体发现在免疫接种IB弱毒苗后 ,第4天即可检测到IgG抗体 ,峰值在第3周。试验鸡在通过滴鼻、点眼途径人工感染IBV强毒后 ,第5天抗体滴度明显上升。我们认为 ,该法是目前我国SPF鸡质量监测、养鸡生产中进行IB监测较好的方法。 展开更多
关键词 传染性支气管炎 ELISA抗体 检测试剂盒 研制技术
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致鸡产蛋下降禽病原的检测基因诊断芯片的研制及临床应用 被引量:1
13
作者 张伟 任素芳 +3 位作者 田振宇 郑彤彤 张秀美 徐怀英 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2010年第8期9-11,共3页
本试验研究的目的是利用RT-PCR技术扩增出新城疫病毒(NDV)、低致病性禽流感病毒(AIV H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合征(EDS)、传染性喉气管炎病毒(ILT)、鸡毒支原体(MG)各一段保守序列,以纤维素酯膜作为生物芯片制作的基质,通... 本试验研究的目的是利用RT-PCR技术扩增出新城疫病毒(NDV)、低致病性禽流感病毒(AIV H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合征(EDS)、传染性喉气管炎病毒(ILT)、鸡毒支原体(MG)各一段保守序列,以纤维素酯膜作为生物芯片制作的基质,通过微量点样技术制作基因芯片(gene chip)。从可疑病料中提取组织核酸,通过掺入法bio-11-dUTP标记,对杂交信号的强弱检测来实现对生物样品的高效分析诊断。 展开更多
关键词 产蛋下降 疾病 基因芯片 诊断应用
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基因芯片在奶牛乳房炎主要致病菌检测中的应用
14
作者 李秀萍 尹逊河 +2 位作者 高晨 尹燕博 吴时友 《山东畜牧兽医》 2008年第6期53-55,共3页
基因芯片是近年来迅速发展的一门生物高新技术,它以其能够快速、高效、大规模地同步检测的功能而得到发展。在奶牛乳房炎主要致病菌的检测中显示出重要的理论和实用价值。本文就基因芯片技术的原因、技术要点以及在奶牛乳房炎检测中的... 基因芯片是近年来迅速发展的一门生物高新技术,它以其能够快速、高效、大规模地同步检测的功能而得到发展。在奶牛乳房炎主要致病菌的检测中显示出重要的理论和实用价值。本文就基因芯片技术的原因、技术要点以及在奶牛乳房炎检测中的应用作一综述。 展开更多
关键词 基因芯片 奶牛乳房炎 致病菌检测 探针
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犬类几种常见传染病诊断中基因芯片的应用 被引量:1
15
作者 许紫建 杨玫 吴时友 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第8期32-33,共2页
采用PCR技术扩增出犬腺病毒(CAV)ORF(P-VIII)基因、犬细小病毒(CPV)VP2基因、鸡血红蛋白的珠蛋白基因片断;采用RT-PCR扩增出犬冠病毒(CCV)纤突蛋白(S)基因、犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白(F)基因、犬副流感病毒(CPIV)核衣壳结构蛋白(NP)基因... 采用PCR技术扩增出犬腺病毒(CAV)ORF(P-VIII)基因、犬细小病毒(CPV)VP2基因、鸡血红蛋白的珠蛋白基因片断;采用RT-PCR扩增出犬冠病毒(CCV)纤突蛋白(S)基因、犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白(F)基因、犬副流感病毒(CPIV)核衣壳结构蛋白(NP)基因、狂犬病病毒(RV)核蛋白(N)基因的各一段保守序列,纯化后点在硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。通过RT-PCR将生物素标记到被检样品的核酸上,将已经标记的扩增产物与诊断基因芯片进行特异性的逆向点杂交,然后扫描仪对芯片进行扫描分析、判断。结果表明,此方法比病毒分离、HI、PCR方法灵敏度高、特异性强,平均检出率要高20%以上,并可同时对犬多种疫病进行快速诊断。 展开更多
关键词 基因芯片 快速诊断 常见传染病 犬类 PCR技术 生物素标记 应用 犬副流感病毒
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