目的:克隆人高迁移率族B1Abox(HMGB1 A box)基因,构建高效稳定的大肠杆菌(E.coli)表达菌株,并探讨其对免疫复合物(IC)刺激单核细胞活化的抑制作用。方法:根据本室优化合成的HMGB1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因片段并插入克隆载体pMD...目的:克隆人高迁移率族B1Abox(HMGB1 A box)基因,构建高效稳定的大肠杆菌(E.coli)表达菌株,并探讨其对免疫复合物(IC)刺激单核细胞活化的抑制作用。方法:根据本室优化合成的HMGB1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因片段并插入克隆载体pMD19-T,菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆。重组克隆载体经NdeⅠ和XhoⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,插入表达载体pQE-T7-2的相应位点,菌落PCR鉴定重组表达载体。重组菌株经IT-PG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定重组蛋白。Ni2+-NTA层析柱纯化重组人HMGB1 A box,RT-PCR检测其对IC刺激单核细胞活化的抑制作用。结果:获得重组人HMGB1 A box的表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。Western blot显示重组蛋白能与抗人HMGB1多克隆抗体和抗His-Tag多克隆抗体特异反应。目的蛋白纯度高达90%以上,并能有效抑制IC诱导单核细胞分泌BAFF、IFN-γ及TNF-α。结论:成功构建了重组人HMGB1 A Box的表达载体,纯化的重组蛋白能有效抑制IC刺激单核细胞活化后细胞因子的分泌。展开更多
文摘目的:克隆人高迁移率族B1Abox(HMGB1 A box)基因,构建高效稳定的大肠杆菌(E.coli)表达菌株,并探讨其对免疫复合物(IC)刺激单核细胞活化的抑制作用。方法:根据本室优化合成的HMGB1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因片段并插入克隆载体pMD19-T,菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆。重组克隆载体经NdeⅠ和XhoⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,插入表达载体pQE-T7-2的相应位点,菌落PCR鉴定重组表达载体。重组菌株经IT-PG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定重组蛋白。Ni2+-NTA层析柱纯化重组人HMGB1 A box,RT-PCR检测其对IC刺激单核细胞活化的抑制作用。结果:获得重组人HMGB1 A box的表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。Western blot显示重组蛋白能与抗人HMGB1多克隆抗体和抗His-Tag多克隆抗体特异反应。目的蛋白纯度高达90%以上,并能有效抑制IC诱导单核细胞分泌BAFF、IFN-γ及TNF-α。结论:成功构建了重组人HMGB1 A Box的表达载体,纯化的重组蛋白能有效抑制IC刺激单核细胞活化后细胞因子的分泌。
