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虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒表达载体的构建与鉴定
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作者 马春玲 王芳 +1 位作者 刘琳琳 王法权 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期900-904,共5页
目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础。方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体。首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因... 目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础。方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体。首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接、转化、提取质粒等方法克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci。表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性。结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性。结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础。 展开更多
关键词 虫荧光色素酶报告基因 5型腺病毒 腺病毒表达载体 定量检测 中和抗体
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