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新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)HSP42基因沉默突变株的构建及其生物学特性
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作者 万能 王群 +5 位作者 王石 徐文梦 赵丽丽 孙文秀 张修国 李伟 《山东农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2021年第1期1-6,共6页
丝孢真菌是自然界中一类广泛存在的真核微生物,匍柄霉属(Stemphylium)是丝孢真菌中的一个重要类群,而新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)是其中的典型种,是研究丝孢真菌有性、无性进化的适用材料。热休克蛋白(Heat shock protein,HS... 丝孢真菌是自然界中一类广泛存在的真核微生物,匍柄霉属(Stemphylium)是丝孢真菌中的一个重要类群,而新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)是其中的典型种,是研究丝孢真菌有性、无性进化的适用材料。热休克蛋白(Heat shock protein,HSP),是一类进化保守的蛋白质家族,在生物体中发挥着重要的生理功能。本研究以S.eturmiunum为实验材料,克隆鉴定了热休克蛋白42(HSP42)基因,通过根癌农杆菌介导的匍柄霉属遗传转化系统,获得了HSP42(03717)基因沉默菌株。以S.eturmiunum WT菌株为对照,对03717沉默菌株的生物学特性进行观察发现:沉默03717后,其菌落生长减缓,菌丝细胞核分布不均匀;沉默03717后其产分生孢子时间推迟,产孢量减少,且经低温诱导后无法产生子囊壳及子囊孢子,说明HSP42基因对S.eturmiunum的无性和有性发育具有重要影响。本研究为S.eturmiunum有性无性发育及小热休克蛋白功能研究提供了更多依据。 展开更多
关键词 新西兰匍柄霉 热休克蛋白 基因沉默
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辣椒疫霉菌诱导辣椒酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定 被引量:9
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作者 王玉姣 陈姗姗 +3 位作者 孙柏华 艾聪聪 王中洋 张修国 《山东农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2018年第3期379-382,共4页
辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是在世界范围内广泛分布的毁灭性病害之一,对我国辣椒生产造成严重的经济损失。为深入研究辣椒疫霉的致病机制,寻找辣椒疫霉在辣椒体内的互作蛋白,利用SMART同源重组交换技术,在酵母菌株... 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是在世界范围内广泛分布的毁灭性病害之一,对我国辣椒生产造成严重的经济损失。为深入研究辣椒疫霉的致病机制,寻找辣椒疫霉在辣椒体内的互作蛋白,利用SMART同源重组交换技术,在酵母菌株Y187中构建了被辣椒疫霉侵染不同时期辣椒的cDNA文库。文库质量评定结果显示cDNA文库的滴度为1.13×10~6 CFU/m L,文库的库容量为1.7×10~7 CFU,文库的重组率为96%,插入片段平均长度在1Kbp左右。该文库的构建为研究辣椒疫霉的致病机制、辣椒的抗病机制及寻找药物靶标位点奠定基础。 展开更多
关键词 辣椒疫霉菌 辣椒 酵母双杂交 CDNA文库
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辣椒疫霉效应因子RxLR115890不同侵染时期的差异性表达 被引量:2
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作者 张丽 王俪颖 +4 位作者 梁涛 丁鹏 朱彤彤 张修国 李壮 《山东农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2018年第3期388-392,共5页
辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)能够产生370多个RxLR效应分子,绝大多数效应分子的特性都是未知的。为了对辣椒疫霉RxLR效应因子开展深入的功能研究,本研究以辣椒疫霉SD33菌株的DNA为模板,设计辣椒疫霉菌以及RxLR115890的特异性引物... 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)能够产生370多个RxLR效应分子,绝大多数效应分子的特性都是未知的。为了对辣椒疫霉RxLR效应因子开展深入的功能研究,本研究以辣椒疫霉SD33菌株的DNA为模板,设计辣椒疫霉菌以及RxLR115890的特异性引物。采用实时荧光定量PCR检测RxLR115890在辣椒疫霉游动孢子侵染条件下,不同时间的表达量。结果显示,RxLR115890的表达量在侵染前期有明显的上调表达,伴随着侵染时间的加长表达量迅速下降,又在12 h处再次轻微上调。由此得出结论,RxLR115890对辣椒疫霉菌的前期侵染具有至关重要的作用。为RxLR115890后续的研奠定了基础。 展开更多
关键词 辣椒疫霉 RxLR115890 实时荧光定量PCR 表达量
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利用酵母双杂交技术筛选卵菌效应因子互作蛋白概述 被引量:6
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作者 盛慧 陈姗姗 +2 位作者 艾聪聪 冯锐 张修国 《山东农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2019年第3期357-360,共4页
蛋白质是生命活动的执行者,其通过与 DNA、RNA、蛋白质、脂类以及多糖等物质结合形成复合体以参与信号转导、防卫反应等复杂的生命活动,因此研究蛋白质之间相互作用可为揭示生命现象本质提供依据。酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)系... 蛋白质是生命活动的执行者,其通过与 DNA、RNA、蛋白质、脂类以及多糖等物质结合形成复合体以参与信号转导、防卫反应等复杂的生命活动,因此研究蛋白质之间相互作用可为揭示生命现象本质提供依据。酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)系统是筛选互作蛋白最常用的方法,它具快速、灵敏、简便、高效、广泛的优点。卵菌是一类危害严重的植物病原菌,可分泌效应因子,直接或间接与寄主体内的蛋白发生作用从而促进病原菌侵染与定植,引起寄主发病或者干扰、抑制寄主的抗病反应,但目前对于病原卵菌效应因子的寄主靶标以及效应因子增加寄主对病原菌的敏感性机制知之甚少,因此,利用酵母双杂交技术筛选植物病原卵菌效应因子互作蛋白,为探明其致病机制显得尤为重要。 展开更多
关键词 酵母双杂交技术 互作蛋白 卵菌 效应因子
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辣椒疫霉效应因子RxLR101012的表达纯化与结晶初探 被引量:2
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作者 马璐璐 王玉姣 +2 位作者 孙柏华 陈姗姗 张修国 《山东农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 2017年第2期210-214,共5页
植物病原卵菌会分泌一系列的效应分子进入寄主体内,从而促进病原菌的侵染。这些效应分子或在质外体积累或进入宿主细胞内来调控寄主的免疫反应。但效应分子如何逃避寄主的免疫识别,使植物发病的分子机制目前还不清楚。本研究从辣椒疫霉... 植物病原卵菌会分泌一系列的效应分子进入寄主体内,从而促进病原菌的侵染。这些效应分子或在质外体积累或进入宿主细胞内来调控寄主的免疫反应。但效应分子如何逃避寄主的免疫识别,使植物发病的分子机制目前还不清楚。本研究从辣椒疫霉强致病性菌株SD33中克隆分离获得1个效应分子Rx LR101012,利用相关生物信息学软件分析了该效应分子的基因序列,并对其进行了原核表达与纯化,确定了该基因高效表达条件,利用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,获得Rx LR101012高纯度蛋白,得到Rx LR101012蛋白晶体,为后续解析Rx LR效应分子蛋白三维结构,从结构生物学角度探知Rx LR效应分子生理生化功能奠定了基础。 展开更多
关键词 辣椒疫霉 效应分子 原核表达 蛋白纯化
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辣椒疫霉菌效应因子RxLR23克隆与基因敲除体系建立 被引量:1
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作者 姜海滨 李京 +2 位作者 许海青 陈茹雪 张修国 《山东农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 2017年第4期491-496,共6页
在辣椒疫霉侵染寄主的过程中,病原菌能够分泌大量的Rx LR效应因子,协助病原菌干扰寄主植物的抗病反应。长期以来,由于缺乏有效的定向诱变和基因置换的技术严重阻碍了关于疫霉菌的致病性的遗传研究。为了深入开展辣椒疫霉Rx LR效应因子... 在辣椒疫霉侵染寄主的过程中,病原菌能够分泌大量的Rx LR效应因子,协助病原菌干扰寄主植物的抗病反应。长期以来,由于缺乏有效的定向诱变和基因置换的技术严重阻碍了关于疫霉菌的致病性的遗传研究。为了深入开展辣椒疫霉Rx LR效应因子的功能研究,本项研究以辣椒疫霉菌株SD33总DNA为模板,设计引物,克隆出基因Rx LR23的序列。以Rx LR23基因序列为模版设计sg RNA构建p YF2.3G-ribo-sg RNA重组载体以及设计构建同源修复供体载体p Bluescript II KS+重组载体。利用CRISPR/cas9系统敲除基因Rx LR23,经G418抗性筛选和PCR扩增验证,成功获得了基因Rx LR23的4个敲除突变体。 展开更多
关键词 辣椒疫霉 效应因子 CRISPR/cas9 基因敲除
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分裂泛素化酵母双杂交系统研究信息素因子STE2蛋白相互作用 被引量:1
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作者 刘小缦 王群 +2 位作者 王石 高素素 王晓梅 《山东农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2019年第1期35-39,共5页
真菌的进化、分化及有性发育趋势受若干性别基因的调控,如交配型、信息素因子及异源三聚体G-蛋白ɑ-亚基基因等;同时,信息素因子调控真菌的有性生殖在酿酒酵母中也得到充分研究。匍柄霉属(Stemphylium)是丝状子囊真菌中的一类重要真菌类... 真菌的进化、分化及有性发育趋势受若干性别基因的调控,如交配型、信息素因子及异源三聚体G-蛋白ɑ-亚基基因等;同时,信息素因子调控真菌的有性生殖在酿酒酵母中也得到充分研究。匍柄霉属(Stemphylium)是丝状子囊真菌中的一类重要真菌类群,许多丝状子囊真菌属、种中含有信息素因子。在自然界中,匍柄霉属真菌大多数是以无性态的形式存在,但其中也有一小部分存在有性生殖阶段。为了深入研究信息素受体STE2及其相关基因对匍柄霉属典型种有性生殖的影响,本研究选取含有信息素因子STE2的匍柄霉属典型种Stemphylium eturmiunum为试验材料,克隆鉴定了信息素受体STE2,然后将其构建至诱饵蛋白表达载体上,并在cDNA文库初筛得到数个疑似互作蛋白片段基础上,克隆其基因全长构建至靶蛋白表达载体上,并利用分裂泛素化的膜酵母双杂交系统,进行一对一验证筛选STE2的相关互作蛋白。该研究筛选出的互作蛋白结果为后期的CO-IP、Poll-Down实验提供了基础。 展开更多
关键词 信息素因子STE2 匍柄霉属 分裂泛素酵母双杂交 互作蛋白
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辣椒疫霉效应分子RxLR19781与其互作蛋白的酵母互作一对一验证 被引量:2
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作者 陈姗姗 艾聪聪 +5 位作者 盛慧 孙柏华 冯锐 王中洋 黄恺浩 王晓梅 《山东农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2019年第1期44-48,共5页
辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是毁灭性土传病害,短期内暴发成灾,该病害严重发生常给辣椒生产造成严重损失。植物病原卵菌分泌大量的胞内效应分子,即RxLR效应分子,能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能,在病原卵... 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是毁灭性土传病害,短期内暴发成灾,该病害严重发生常给辣椒生产造成严重损失。植物病原卵菌分泌大量的胞内效应分子,即RxLR效应分子,能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能,在病原卵菌侵染寄主及与寄主植物互作过程发挥着重要的作用。酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H)系统是研究蛋白质相互作用最常用的方法,它既可以在cDNA文库中筛选互作的未知靶标蛋白,同时还可以验证两个目的蛋白之间的互作关系。本研究分别以辣椒疫霉c DNA基因组,辣椒cDNA基因组为模板,克隆了辣椒疫霉效应因子Rx LR19781以及其疑似互作蛋白泛素连接酶E2 10和辣椒脂质转移蛋白EARLI 1,并将它们分别成功构建到PGBKT7和PGADT7载体上。运用酵母共转化技术,将带有AD载体的互作蛋白和带有BD载体的效应因子共同转化到酵母感受态Y2HGold中,对它们是否存在互作关系进行了深入研究。结果表明,两个疑似互作蛋白都与效应因子RxLR19781互作。但由于酵母双杂交存在一定的假阳性,因此该效应分子与互作蛋白的互作有待进一步深入的研究。 展开更多
关键词 辣椒疫霉菌 RXLR效应分子 酵母双杂交
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沉默氧增强蛋白(OEE2)对辣椒疫霉效应因子RxLR19781的免疫功能影响
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作者 梁涛 王俪颖 +3 位作者 朱彤彤 马艳飞 江韦霖 冀瑞卿 《山东农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2019年第1期40-43,共4页
辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种寄生范围广且能够产生大量RxLR效应因子来参与侵染寄主的病原卵菌。资料表明目前对多数辣椒疫霉RxLR效应因子在植物体内如何行使功能积累较少。本研究从辣椒疫霉菌中分离鉴定1个效应分子RxLR197... 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种寄生范围广且能够产生大量RxLR效应因子来参与侵染寄主的病原卵菌。资料表明目前对多数辣椒疫霉RxLR效应因子在植物体内如何行使功能积累较少。本研究从辣椒疫霉菌中分离鉴定1个效应分子RxLR19781,为了初步明确RxLR19781的功能特性,本研究借助于烟草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus,TRV)介导的基因沉默技术,将RxLR19781的互作蛋白基因NbOEE2在本氏烟中瞬时沉默,通过qRT-PCR验证得到NbOEE2沉默植株,在沉默后的本氏烟植株中接种RxLR19781并验证该RxLR效应因子的功能。结果表明,在NbOEE2沉默植株上,RxLR19781不抑制辣椒疫霉游动孢子侵染。本研究结果表明OEE2可有效调控RxLR19781的功能特性,为进一步深入开展辣椒疫霉效应因子RxLR19781功能机制研究奠定了基础。 展开更多
关键词 辣椒疫霉 效应因子 TRV 基因沉默
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