安徽省809株肺炎克雷伯菌感染的临床分布、耐药性与基因型分析 被引量：19

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作者 程君 魏文娟 +3 位作者 杨海飞 刘艳艳 叶英 李家斌 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期460-465,共6页

目的了解安徽省2013年与2014年肺炎克雷伯菌感染的临床分布及耐药情况,为临床合理使用抗菌药物药供参考依据。方法收集安徽省内35所医院送检的临床标本,从中分离出肺炎克雷伯菌株,采用琼脂倍比稀释法进行抗菌药物敏感性测定,用WHONET 5.... 目的了解安徽省2013年与2014年肺炎克雷伯菌感染的临床分布及耐药情况,为临床合理使用抗菌药物药供参考依据。方法收集安徽省内35所医院送检的临床标本,从中分离出肺炎克雷伯菌株,采用琼脂倍比稀释法进行抗菌药物敏感性测定,用WHONET 5.6和SPSS l7.0软件对肺炎克雷伯菌的来源、耐药率及其变化情况进行统计分析。结果 2013—2014年共分离出肺炎克雷伯菌809株,其中来源于ICU的标本中的检出率最高,平均检出率为30.7%。绝大部分菌株分离于痰液标本,占总菌株的57.8%。两年的菌株产ESBLs菌株的检出率分别为32.5%和38.9%,多重耐药检出率分别为37.2%和40.9%。药物敏感试验结果显示:在所有进行检测的抗菌药物里,碳青霉烯类药物的耐药率最低;耐药率最高的药物为氨苄西林,分别为55.4%和63.4%。产ESBLs的肺炎克雷伯菌菌株对多种类抗菌药物的耐药率均高于非产ESBLs菌株。282株产ESBLs肺炎克雷伯菌中,97株细菌携带blaCTX-M-14基因。结论临床标本分离出肺炎克雷伯菌株较多,CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶为主要的耐药机制,因此该菌株对临床常用的各类抗菌药物呈现出不同程度的耐药;治疗上可优先选用含酶抑制剂的复合制剂或碳青霉烯类药物。加强细菌的耐药性监测与防控,有利于临床合理使用抗菌药物。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌 药物敏感性 细菌耐药监测 基因型

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安徽省产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌耐药性和基因型研究 被引量：6

2

作者 高伟 孙震 +4 位作者 殷俊 王谦 程君 叶英 李家斌 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期48-51,共4页

目的了解安徽地区产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBIs)的肺炎克雷伯菌检出率,确定其基因型,并对其流行病学特征进行研究。方法纸片法进行表型鉴定;PCR检测产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶菌株;分析基因型;琼脂稀释法进行药物敏感试验。结果5... 目的了解安徽地区产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBIs)的肺炎克雷伯菌检出率,确定其基因型,并对其流行病学特征进行研究。方法纸片法进行表型鉴定;PCR检测产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶菌株;分析基因型;琼脂稀释法进行药物敏感试验。结果52株肺炎克雷伯菌经通用引物PCR检测证实产CTX-M酶,占所有分离菌株的23.4%(52/222),占产ESBLs菌株的49.5%(52/105);经序列分析显示:15株CTX-M-1组阳性结果有12株表达CTX-M-22,2株表达CTX-M-15,1株表达CTX-M-3;37株CTX-M-9组阳性结果有35株表达CTX-M-14,2株表达CTX-M-24;CTX-M-2组和CTX-M-8组未检测出;其中有2株新基因被检出(序列号分别为EU136031和EU202673);药敏结果显示临床野生菌株对多种β-内酰胺类耐药,对哌拉西林/三唑巴坦、阿米卡星、头孢他啶相对较敏感。结论安徽地区CTX-M酶以CTX-M-14型和CTX-M-22型为主,同时存在变异型;药敏结果显示产酶菌株对头孢噻肟和头孢曲松、氨苄西林高度耐药。 展开更多

关键词 超广谱β-内酰胺酶类 肺炎克雷伯菌 CTX-M基因 耐药性

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2007—2009年安徽省痰标本中分离的革兰阴性菌耐药性监测 被引量：11

3

作者 费君 李家斌 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期948-951,共4页

目的分析2007—2009年安徽省临床分离痰标本中革兰阴性菌对抗菌药物耐药性变迁情况。方法采用2009年美国CLSI推荐的琼脂对倍稀释法进行抗菌药物敏感实验,计算抗菌药物的耐药率、敏感率和中介率,结果采用SPSS11.5软件进行统计分析。结果 ... 目的分析2007—2009年安徽省临床分离痰标本中革兰阴性菌对抗菌药物耐药性变迁情况。方法采用2009年美国CLSI推荐的琼脂对倍稀释法进行抗菌药物敏感实验,计算抗菌药物的耐药率、敏感率和中介率,结果采用SPSS11.5软件进行统计分析。结果 2007年1月至2009年12月从临床送检的痰标本中分离出革兰阴性菌1492株。来自ICU的不动杆菌对亚胺培南及美罗培南的敏感率分别为70.0%和61.3%,其对哌拉西林/三唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星和环丙沙星的耐药率均高于非ICU菌株。来自ICU与非ICU的铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、头孢他啶的敏感率均在50%以上。来自ICU的铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南和庆大霉素的耐药率均高于非ICU菌株。肺炎克雷伯菌对哌拉西林/三唑巴坦、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星的耐药率低于30%。大肠埃希菌对哌拉西林/三唑巴坦、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星的耐药率在30%以下,对氨苄西林、头孢曲松、氨曲南、庆大霉素、氟喹诺酮类的耐药率大于50%。结论定期进行耐药性监测有助于了解我省细菌耐药性变迁,为临床经验用药提供依据。 展开更多

关键词 不动杆菌 铜绿假单胞菌 肺炎克雷伯菌:大肠埃希菌 药物敏感试验 细菌耐药监测

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合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株的SHV型耐药基因分布和耐药性分析 被引量：5

4

作者 程君 王迎迎 +1 位作者 李慧 李家斌 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期812-815,共4页

目的了解1999～2000年合肥市临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中,SHV型β-内酰胺酶基因型分布情况和耐药性分析。方法标本为安徽省细菌耐药性监控中心所留取的1999年9月～2000年9月从合肥市4家大医院临床... 目的了解1999～2000年合肥市临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中,SHV型β-内酰胺酶基因型分布情况和耐药性分析。方法标本为安徽省细菌耐药性监控中心所留取的1999年9月～2000年9月从合肥市4家大医院临床分离的、已被证实产ESBLs的98株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,采用聚合酶链反应(PCR)扩增产SHV型β-内酰胺酶菌株基因片段,克隆入pGEM-Teasy载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列以鉴定基因型。按照2005年CLSI推荐标准,用琼脂稀释法分别测定临床分离菌株和转移结合子对11种不同抗菌药物的MIC值,并比较分析两者的不同结果。结果98株产ESBLs菌株中有29株产SHV型β-内酰胺酶,其中SHV-1型8株,SHV-11型5株,SHV-12型11株,SHV-18型1株,SHV-28型1株,SHV-89型3株[序列号为(DQ193536)]。临床分离株的MIC结果显示对哌拉西林,头孢噻肟,头孢曲松的敏感率低;转移结合子的敏感性较临床分离菌株有所上升。结论合肥市部分医院产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌检出率较高,我们在国内外首次报道了SHV-89;并且本地区产SHV型β-内酰胺酶菌株的耐药性较高。 展开更多

关键词 超广谱Β-内酰胺酶 SHV型β-内酰胺酶 聚合酶链反应 序列分析 基因型 耐药性

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2017-2018年度安徽省流感流行病学特征分析 被引量：10

5

作者 盛男 殷俊 +4 位作者 程君 陈昊然 吴家兵 朱梦 李家斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第1期152-156,共5页

目的通过对2017-2018年度安徽省流行性感冒(简称流感)的流行病学特征进行分析,为制定流感防治措施提供依据。方法对中国疾病预防控制中心信息系统监控的2017—2018年度的流感样病例(ILI)监测资料、病原学监测资料进行分析,应用SPSS 16.... 目的通过对2017-2018年度安徽省流行性感冒(简称流感)的流行病学特征进行分析,为制定流感防治措施提供依据。方法对中国疾病预防控制中心信息系统监控的2017—2018年度的流感样病例(ILI)监测资料、病原学监测资料进行分析,应用SPSS 16.0软件进行数据分析。结果 2017-2018年度安徽省ILI数和平均流感样病例百分比(ILI%)分别为283 827例、4.42%。ILI病例数和ILI%都具有明显的季节性,在2018年的1月有1个明显的高峰。ILI以0~4岁组所占比例最高(59.74%),60岁及以上年龄组所占比例最低(3.36%);2017-2018年度安徽省共分离检测ILI标本38 869例,阳性病例5 490例,阳性率14.12%。不同月份、不同年龄段之间核酸检测阳性率差异均有统计学意义(P<0.001);不同月份、年龄段之间流感病毒亚型构成差异均具有统计学意义(χ^(2)=7 092.0,P<0.001;χ^(2)=879.1,P<0.001)。ILI病例数与ILI%、流感病毒检出率均呈正相关(rs=0.585,P<0.05;rs=0.691,P<0.05)。结论 ILI的高发人群是0~4岁的儿童,2018年1月的ILI病例数相比较于2017年有1个激增,不同亚型交替成为优势毒株,不同年龄段感染主要病毒亚型不同。 展开更多

关键词 流行性感冒 人群监测 流行病学

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肠杆菌属细菌高产AmpC酶检测方法的比较研究

6

作者 周强 王中新 徐元宏 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2005年第3期290-292,共3页

目的评价纸片耐药表型推断法和双纸片邻氯西林增效试验应用于临床实验室检测肠杆菌属细菌高产AmpC酶的可行性。方法采用头孢西丁三维试验、纸片耐药表型推断法和双纸片邻氯西林增效试验对104株临床分离的肠杆菌属细菌进行高产AmpC酶检测... 目的评价纸片耐药表型推断法和双纸片邻氯西林增效试验应用于临床实验室检测肠杆菌属细菌高产AmpC酶的可行性。方法采用头孢西丁三维试验、纸片耐药表型推断法和双纸片邻氯西林增效试验对104株临床分离的肠杆菌属细菌进行高产AmpC酶检测,以头孢西丁三维试验为标准,与后两种方法进行比较,计算两种方法的灵敏度和特异性。结果经头孢西丁三维试验检测,104株肠杆菌属细菌中高产AmpC酶有15株,其中阴沟肠杆菌11株,产气肠杆菌3株,河生肠杆菌1株,总检出率为14.4%。纸片耐药表型推断法的符合率为91.3%,灵敏度为86.7%,特异性为92.1%。双纸片邻氯西林增效试验的符合率95.1%,灵敏度为93.3%,特异性为95.5%。结论纸片耐药表型推断法和双纸片邻氯西林增效试验与三维试验相比有较高的符合率,且操作简便,适合在临床实验室检测肠杆菌属细菌高产AmpC酶中应用。 展开更多

关键词 Β内酰胺酶 肠杆菌属 微生物学技术

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p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

7

作者 张春 苏丛 +1 位作者 伍婷 朱立雨 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第3期398-402,共5页

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10... 目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。 展开更多

关键词 P62 慢病毒载体构建 三质粒包装系统 THP-1细胞 肺炎克雷伯菌 过表达

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耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制研究 被引量：20

8

作者 孙震 殷俊 +3 位作者 高伟 叶英 程君 李家斌 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期52-56,共5页

目的对临床分离的14株耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制进行研究。方法药敏试验检测对15种常用抗菌药物的耐药情况;协同试验筛选产金属酶菌株和聚合酶链反应检测金属酶基因及oprD基因;氰氯苯腙检测主动外排情况及其对亚胺培南最低抑菌... 目的对临床分离的14株耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制进行研究。方法药敏试验检测对15种常用抗菌药物的耐药情况;协同试验筛选产金属酶菌株和聚合酶链反应检测金属酶基因及oprD基因;氰氯苯腙检测主动外排情况及其对亚胺培南最低抑菌浓度(MIC)的影响。结果耐亚胺培南的铜绿假单胞菌对其它常用抗菌药物耐药率也很高,其中,5株产VIM-2型金属酶,11株oprD基因检测阴性。2株在有氰氯苯腙存在时对亚胺培南的MIC降低至原值的1/4,表明这2株有主动外排系统参与对亚胺培南的耐药。结论OprD2蛋白表达缺失是本研究中铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因,其次为产VIM-2型金属酶和主动外排系统,且至少有4株存在两种以上耐亚胺培南的机制。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 金属酶 OprD2蛋白 主动外排系统

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肺炎克雷伯菌肝脓肿小鼠模型的制备与评价 被引量：2

9

作者 郑亚虹 岳程程 +4 位作者 张慧 贺玲玲 戴媛媛 刘艳艳 李家斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第11期1701-1706,共6页

目的构建稳定且可靠的肺炎克雷伯菌肝脓肿(KPLA)小鼠模型,为该疾病的后续研究提供依据。方法选择肺炎克雷伯菌(KP)临床分离菌株181608为实验菌株,将不同浓度的细菌悬液通过腹腔注射,利用改良寇式法计算半数致死量(LD50),以1/2的LD50浓... 目的构建稳定且可靠的肺炎克雷伯菌肝脓肿(KPLA)小鼠模型,为该疾病的后续研究提供依据。方法选择肺炎克雷伯菌(KP)临床分离菌株181608为实验菌株,将不同浓度的细菌悬液通过腹腔注射,利用改良寇式法计算半数致死量(LD50),以1/2的LD50浓度注射C57BL/6J小鼠。通过小鼠一般情况、体质量变化、白细胞计数、HE染色以及肝脏菌落计数等指标综合评价该模型。结果根据改良寇式法计算出KP在C57BL/6J小鼠中的LD50约为104 CFU/ml。小鼠感染细菌24 h取肝脏脓肿部位的细菌培养结果为阳性,通过菌落形态、拉丝试验阳性和质谱结果鉴定致病菌为KP。HE染色结果提示小鼠感染后肝脏出现大面积坏死以及炎性细胞的大量浸润。随着感染时间的延长,小鼠精神状况变差,加之进食量的减少,体质量逐渐降低。检测造模小鼠的白细胞数高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。除此之外,谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和炎症因子[白细胞介素(IL)-1β、IL-5和肿瘤坏死因子(TNF)-α]在肝脓肿组明显升高,且RT-qPCR结果也显示炎性和趋化因子[IL-1β、IL-6、IL-10和单核细胞趋化蛋白(MCP)-1]的mRNA水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过腹腔注射成功建立KPLA小鼠感染模型,为肝脓肿的研究提供稳定和易复制的动物模型。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌 肝脓肿 动物模型

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巨噬细胞Lamtor2基因敲除小鼠对肺炎克雷伯菌易感性的研究 被引量：4

10

作者 苏丛 伍婷 +5 位作者 徐方明 陈昊然 刘艳艳 律娜 兰燕虎 李家斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第4期505-509,共5页

目的通过建立Lamtor2巨噬细胞条件敲除小鼠感染肺炎克雷伯菌(Kp)模型,初步研究Lamtor2基因生物学功能及其在Kp感染过程中的相关机制。方法将引进的Lamtor2^(flox/+)小鼠自交,Lyz2-Cre小鼠与Lamtor2^(flox/+)进行杂交,获得基因型为Lamtor... 目的通过建立Lamtor2巨噬细胞条件敲除小鼠感染肺炎克雷伯菌(Kp)模型,初步研究Lamtor2基因生物学功能及其在Kp感染过程中的相关机制。方法将引进的Lamtor2^(flox/+)小鼠自交,Lyz2-Cre小鼠与Lamtor2^(flox/+)进行杂交,获得基因型为Lamtor2^(flox/flox)Lyz2-Cre^(-/-)和Lamtor2^(flox/+)Lyz2-Cre^(+/-)的子代小鼠;将上述两种基因型子代小鼠进行杂交,得到对照组小鼠(Lamtor2^(flox/flox)Lyz2-Cre^(-/-))和Lamtor2条件性基因敲除小鼠(Lamtor2^(flox/floxLyz)2-Cre^(+/-))。提取小鼠脚趾基因组DNA,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定子代小鼠基因型并提取肺泡巨噬细胞,利用qRT-PCR和Western blot验证Lamtor2基因敲除效果。小鼠感染Kp,观察生存状况;体外采用RT-qPCR检测Kp感染肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和Cxcl1表达水平,两组间比较采用t检验;Western blot验证iNOS的表达水平。结果成功建立Lamtor2条件性基因敲除小鼠模型,子代存活且可育;与对照组小鼠比较,实验组小鼠在感染Kp后生存率降低;Lamtor2^(flox/flox)Lyz2-Cre^(+/-)小鼠来源的肺泡巨噬细胞中的TNF-α(t=17.54,P=0.0032)、IL-1β(t=15.37,P=0.0042)和Cxcl1(t=37.82,P=0.0007)表达水平降低,且iNOS表达下降。结论构建了Lamtor2条件性基因敲除小鼠,感染肺炎克雷伯菌后,小鼠的生存率下降;肺泡巨噬细胞iNOS表达降低。 展开更多

关键词 Lamtor2 条件性基因敲除 繁育 肺炎克雷伯菌

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基于CRISPR-Cas9技术构建gpr41基因敲除的RAW264.7细胞系 被引量：3

11

作者 苏丛 徐方明 +6 位作者 伍婷 张鹏飞 陈昊然 刘艳艳 兰燕虎 李家斌 律娜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2020年第5期800-803,共4页

采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质... 采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质粒转化DH5α感受态细胞,筛选出重组子测序验证gRNA的有效性。鉴定成功的pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒采用转染试剂转染巨噬细胞系RAW264.7。筛选阳性单克隆细胞株,Western blot检测gpr41基因的表达。测序结果证实pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒构建成功;Western blot筛选出重组质粒pLenticrisprV2-gpr41-gRNA3转染RAW264.7细胞13号单克隆株的GPR41蛋白不表达。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了gpr41基因敲除的巨噬细胞株,为研究gpr41基因在RAW264.7细胞中的作用机制奠定基础。 展开更多

关键词 CRISPR-Cas9技术 gpr41 巨噬细胞 基因敲除

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CRISPR/Cas9技术敲除RAW264.7细胞的GPR43基因抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能 被引量：1

12

作者 徐方明 苏丛 +5 位作者 伍婷 陈昊然 张鹏飞 刘艳艳 兰燕虎 李家斌 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期481-486,共6页

目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sg... 目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sgRNA插入pLenticrisprV2质粒中,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pLenticrisprV2;将病毒感染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序GPR43基因相关序列并与野生型GPR43基因进行比对,确认敲除成功的细胞株(GPR43^-/-RAW264.7细胞),Western blot法检测GPR43蛋白水平。肺炎克雷伯菌感染GPR43^-/-RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测细菌感染后细胞内白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的变化,并观察敲除GPR43后,RAW264.7细胞吞噬能力的变化。结果挑选的单克隆细胞经Western blot验证GPR43蛋白不表达,并且DNA测序结果显示在sgRNA插入位置缺失34个碱基,证明成功敲除GPR43基因。GPR43^-/-RAW264.7细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均低于对照组,且GPR43^-/-RAW264.7细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力降低。结论CRISPR/Cas9技术敲除GPR43基因,抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能及炎性细胞因子的产生。 展开更多

关键词 RAW264.7细胞 成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9) G蛋白偶联受体43(GPR43) 肺炎克雷伯

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晚期内体/溶酶体适配蛋白2(LAMTOR2)基因缺失加重肺炎克雷伯菌引起的小鼠脓毒症

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作者 朱立雨 张春 +3 位作者 葛小花 孟宝 伍婷 李家斌 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期481-486,共6页

目的建立肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染肝组织晚期内体/溶酶体适配蛋白2(LAMTOR2)基因条件敲除小鼠模型,初步探究LAMTOR2基因在K.pneumoniae感染引起肝脓毒症过程中的作用及机制。方法繁育获得肝脏LAMTOR2基因条件性敲除小鼠(LAMTOR2^... 目的建立肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染肝组织晚期内体/溶酶体适配蛋白2(LAMTOR2)基因条件敲除小鼠模型,初步探究LAMTOR2基因在K.pneumoniae感染引起肝脓毒症过程中的作用及机制。方法繁育获得肝脏LAMTOR2基因条件性敲除小鼠(LAMTOR2^(flox/flox);Alb⁃Cre^(+))和同窝阴性对照组小鼠(LAMTOR2^(flox/flox))。提取实验组和对照组小鼠的肝组织,利用实时荧光定量PCR和Western blot法检测LAMTOR2的mRNA和蛋白表达水平确定LAMTOR2在肝组织的敲除效果。实验组和对照组小鼠分别感染K.pneumoniae,观察24、36、48、72 h的小鼠生存率,HE染色观察肝组织病变情况;利用实时荧光定量PCR检测实验组和对照组小鼠感染K.pneumoniae 24 h后肝组织肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)、白细胞介素1β(IL⁃1β)和CXC趋化因子配体1(CXCL1)的mRNA的表达水平。结果成功获得肝组织LAMTOR2基因条件性敲除小鼠;与对照组小鼠相比,实验组小鼠在感染K.pneumoniae后生存率降低,肝组织出现更严重损伤;实验组小鼠肝组织TNF⁃α、IL⁃1β和CXCL1的mRNA表达水平显著降低,小鼠免疫应答能力降低。结论LAMTOR2在K.pneumoniae感染诱导脓毒症的过程中起保护作用。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae) 肝脓毒症 晚期内体/溶酶体适配蛋白2(LAMTOR2) 炎症反应

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Nod2基因在肺炎克雷伯菌肝脓肿中的作用研究

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作者 孟宝 伍婷 +5 位作者 苏丛 孙雅婷 唐明洋 郭明娟 兰燕虎 李家斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2022年第9期1380-1384,共5页

目的建立肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染Nod2基因肝组织条件敲除小鼠模型,初步探究Nod2基因在K.pneumoniae感染引起肝脓肿过程中的作用及机制。方法将引进的Nod2^(flox/+)小鼠自交获得Nod2^(flox/flox)小鼠,同时将Alb-Cre^(+)小鼠与Nod... 目的建立肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染Nod2基因肝组织条件敲除小鼠模型,初步探究Nod2基因在K.pneumoniae感染引起肝脓肿过程中的作用及机制。方法将引进的Nod2^(flox/+)小鼠自交获得Nod2^(flox/flox)小鼠,同时将Alb-Cre^(+)小鼠与Nod2^(flox/+)进行杂交获得Nod2^(flox/+);Alb-Cre^(+)的子代小鼠;将上述两种基因型的子代小鼠进行杂交,获得Nod2基因肝脏条件性敲除小鼠(Nod2^(flox/flox);Alb-Cre^(+))和同窝阴性对照组小鼠(Nod2^(flox/flox))。提取小鼠脚趾基因组DNA,经PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定子代小鼠基因型并提取小鼠肝脏,利用RT-qPCR和Western blot验证Nod2基因在肝脏中的敲除效果。实验组和对照组小鼠分别感染K.pneumoniae,观察不同时间点小鼠生存率及肝组织病理变化;利用RT-qPCR检测实验组和对照组小鼠感染K.pneumoniae 48 h后肝组织内肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和趋化因子CXC配体1(CXCL1)的mRNA的表达水平。结果Nod2^(flox/flox);Alb-Cre^(+)小鼠肝脏NOD2 mRNA表达量降低(P<0.05),Western blot结果显示NOD2蛋白表达量降低;与对照组小鼠比较,实验组小鼠在感染K.pneumoniae后生存率降低(中位生存时间60.5 h,P=0.0469),肝组织出现了更为严重的病理损伤;实验组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β和CXCL1的mRNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NOD2在K.pneumoniae感染诱导肝脓肿的过程中起保护作用。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌肝脓肿 NOD2基因 炎症反应 保护作用

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