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hipA对禽致病性大肠杆菌生物学特性和致病性的影响
1
作者 吴晓妍 吴剑梅 +4 位作者 傅丹丹 涂健 宋祥军 邵颖 祁克宗 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2023年第8期11-18,28,共9页
【目的】探究毒素-抗毒素(TA)系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE8... 【目的】探究毒素-抗毒素(TA)系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE81ΔhipA及回复株C-AE81ΔhipA,测定其生长曲线、运动性、环境耐受能力、细胞黏附能力,并采用实时荧光定量PCR检测环境耐受相关基因(hdeA、hdeB)、黏附相关基因(fimF、fimH)、毒力相关基因(hcp、ompR、ompC)的转录水平,探究毒素蛋白hipA对APEC的生物学功能及致病性的影响。【结果】成功构建hipA基因的缺失株和回复株。野生株AE81、缺失株AE81ΔhipA和回复株C-AE81ΔhipA的生长情况无明显差异。与野生株AE81相比,hipA基因缺失株AE81ΔhipA的运动能力降低,对酸性、碱性、高渗和氧化应激环境的耐受能力减弱,鞭毛和菌毛的数量和长度明显减小,对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的黏附能力极显著减弱(P<0.01),回复株C-AE81ΔhipA各指标基本恢复到野生株水平。实时荧光定量PCR结果显示,与野生株AE81相比,AE81ΔhipA菌株的hdeA、hdeB、fimF、ompR、ompC基因转录水平显著降低(P<0.05),hcp基因转录水平差异不显著,但fimH转录水平显著升高(P<0.05)。【结论】TA系统毒素蛋白hipA影响APEC的运动性、环境耐受能力和对细胞的黏附能力,参与APEC的致病过程。 展开更多
关键词 禽致病性大肠杆菌 毒素-抗毒素系统 hipA基因
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猪圆环病毒3型LAMP-PfAgo检测方法的建立
2
作者 祁钊 余相宇 +1 位作者 陈魏圆 宋祥军 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第2期1-9,31,共10页
【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守... 【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守区域设计PCV3-T1~PCV3-T4等4组引物(每组包括1对内引物和1对外引物),以pMD19-T-PCV3-Rep为模板进行LAMP,筛选最佳引物组,并对LAMP反应的Mg ^(2+)浓度、内外引物浓度、反应温度、反应时间进行优化。根据PCV3 Rep基因的保守序列,设计PCV3-gs1~PCV3-gs5等5组gDNAs和一条特异性探针,进行LAMP-PfAgo反应,筛选最佳的gDNAs,并对LAMP-PfAgo反应体系中PfAgo蛋白浓度、gDNAs浓度、Mn 2+浓度和反应时间进行优化。对该LAMP-PfAgo方法的特异性、敏感性进行评价;并用该方法和实时荧光定量PCR方法对疑似感染PCV3的46份临床样品进行检测,比较结果的一致性。【结果】重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep PCR和测序均获得了891 bp的序列,表明重组阳性质粒构建成功。LAMP最佳引物为PCV3-T1,最佳Mg ^(2+)终浓度为6 mmol/L,最佳内外引物终浓度分别为1.6和1.2μmol/L,最适的反应温度65℃,最佳反应时间60 min。使用优化后的LAMP反应条件对PCV3 Rep基因保守序列进行扩增,并将其用于后续试验。LAMP-PfAgo反应最佳的gDNAs为PCV3-gs1;优化后的PfAgo蛋白终浓度为40 U/μL,gDNAs终浓度为1.50μmol/L,Mn 2+终浓度为1.50 mmol/L,反应时间为30 min。LAMP-PfAgo法的灵敏度为10拷贝/μL,且与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病毒等常见猪源病原核酸无交叉反应。临床样本检测结果显示,LAMP-PfAgo法与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合率为100%。【结论】基于PfAgo蛋白结合LAMP技术建立了对PCV3的核酸检测方法,该方法灵敏度高和特异性强,具有潜在的临床应用价值。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 PfAgo 环介导等温扩增 即时检验 猪
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禽4型腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用
3
作者 张宇 程凡玉 +7 位作者 俞赵荣 邵颖 魏宁波 陈芳芳 王振宇 宋祥军 涂健 祁克宗 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第5期2364-2371,共8页
本研究旨在制备禽4型腺病毒(fowl adenovirus type 4,FAdV-4)的单克隆抗体,鉴定其特异性结合位点,并评估其在免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫沉淀反应中的应用价值。使用纯化的FAdV-4-AH-F41株全病毒免疫小鼠,通过间接酶联免... 本研究旨在制备禽4型腺病毒(fowl adenovirus type 4,FAdV-4)的单克隆抗体,鉴定其特异性结合位点,并评估其在免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫沉淀反应中的应用价值。使用纯化的FAdV-4-AH-F41株全病毒免疫小鼠,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法筛选出一株阳性杂交瘤细胞并进行亚克隆,并对所制备的单克隆抗体进行效价检测。利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)与蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定单克隆抗体生物学特性,构建了pCold TF-Hexon、pET-32a(+)-Fiber1、pCold TF-Penton、pCold TF-Fiber2的原核表达载体,并通过Western blot初步鉴定所得单克隆抗体的特异性结合位点,在检测出抗体的亚型后,将其初步应用于IHC和免疫沉淀试验。结果表明本试验获得1株稳定分泌抗Fiber1蛋白的单克隆抗体,并将其命名为5C7。该抗体效价为1∶102400,亚型为IgG-2b,表现出良好的生物学特性。在IHC中,能够观察到明显的病变特征;在免疫沉淀试验中,5C7可作为捕获抗体,与病毒感染细胞中的Fiber1蛋白特异性结合。结果提示,本试验通过全病毒粒子免疫小鼠所制备的单克隆抗体能够特异性识别Fiber1蛋白,并在IHC和免疫沉淀反应中显示出良好的应用前景,为FAdV-4实验室病理诊断方法的建立和Fiber1蛋白的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 血清4型禽腺病毒 单克隆抗体 抗体鉴定 Fiber1蛋白 IHC 免疫共沉淀
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ETT2转录因子EivF调控禽致病性大肠杆菌运动性和环境胁迫耐受性 被引量：2
4
作者 吴剑梅 傅丹丹 +4 位作者 李佳璇 邵颖 宋祥军 涂健 祁克宗 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2022年第2期438-445,共8页
为探究禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)中大肠杆菌Ⅲ型分泌系统(Escherichia coli TypeⅢsecretion system^(2),ETT2)转录因子EivF的功能,通过透射电镜观察检测野生株(AE81)、缺失株(AE81△eivF)和回复株(AE8... 为探究禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)中大肠杆菌Ⅲ型分泌系统(Escherichia coli TypeⅢsecretion system^(2),ETT2)转录因子EivF的功能,通过透射电镜观察检测野生株(AE81)、缺失株(AE81△eivF)和回复株(AE81△eivF-comp)Curli菌毛的合成能力,并探究3种菌株在不良环境中的存活情况,通过RT-qPCR检测鞭毛和环境耐受相关基因的转录水平。结果表明,与野生株相比,缺失株的curli菌毛合成能力无明显变化,在透射电镜下缺失株鞭毛数量明显减少,缺失株在强酸、强碱、氧化应激、高温、高渗环境中的存活率均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低,回复株上述表型基本恢复。转录组数据显示,缺失株的flgB、flgC、flgE等鞭毛相关基因和proV、cadA等环境耐受相关基因的转录水平下调。RT-qPCR结果显示,flgB、flgC、flgE、proV等基因的转录水平下调。综上所述,ETT2转录因子EivF参与调控禽致病性大肠杆菌运动能力和在不良环境中的存活能力。 展开更多
关键词 禽致病性大肠杆菌 ETT2转录因子EivF 鞭毛 环境胁迫
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禽致病性大肠杆菌Hcp2b对雏鸡脾脏mRNA表达谱的影响
5
作者 宋祥军 宋自超 +6 位作者 沈啸 陈哲 蒋胡艳 侯曼曼 邵颖 涂健 祁克宗 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2022年第1期232-238,共7页
为研究效应蛋白Hcp2b在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染雏鸡过程中对脾脏的转录组学影响,利用兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室构建保存的hcp2b基因缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b肌肉注射7日龄雏鸡(以AE17菌株为阳性对照),感染24 h... 为研究效应蛋白Hcp2b在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染雏鸡过程中对脾脏的转录组学影响,利用兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室构建保存的hcp2b基因缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b肌肉注射7日龄雏鸡(以AE17菌株为阳性对照),感染24 h后采集精神沉郁的雏鸡脾脏检测组织载菌量并制作病理切片。选取缺失株Δhcp2b及野生株AE17感染脾脏组织进行转录组学测序,采用Real-time PCR进行测序结果鉴定;而后对差异表达基因进行GO分析、KEGG通路富集分析。结果显示,野生株AE17、缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b在脾脏组织载菌量差异不明显。组织切片观察发现,野生株AE17和缺失株Δhcp2b脾脏均出现组织间隙扩大,有充血现象出现。转录组学分析发现,缺失株Δhcp2b感染雏鸡脾脏后,诱导了脾脏基因mRNA的差异表达,筛选到515个差异表达基因(330个基因下调表达,185个基因上调表达)。Real-time PCR结果发现,Δhcp2b感染雏鸡后,脾脏中IL22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因mRNA表达量下调,与测序结果变化趋势一致。GO分析发现,感染24 h雏鸡脾脏差异基因富集在膜、膜的组成、细胞外间隙部分等条目。KEGG分析发现,脾脏差异基因显著富集在内质网蛋白质加工过程的信号通路中。hcp2b基因对APEC在定植脾脏无影响,hcp2b通过影响机体免疫器官中脾脏的内质网蛋白质加工过程的信号通路来参与致病过程。 展开更多
关键词 雏鸡 禽致病性大肠杆菌 HCP 脾脏 内质网蛋白质加工通路
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鸡cGAS基因的克隆、表达特性分析及FAdV-4感染前后亚细胞定位变化
6
作者 曹影丽 刘琪 +6 位作者 柴震震 杨侃侃 梁月巧 宋祥军 邵颖 涂健 祁克宗 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第2期453-460,共8页
cGAS作为一种新型的胞质DNA受体,在宿主抵抗DNA病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用。血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是无囊膜的一种双链DNA病毒,可引起鸡肝炎-心包积液综合征。为明确鸡cGAS(chcGAS)基因功... cGAS作为一种新型的胞质DNA受体,在宿主抵抗DNA病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用。血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是无囊膜的一种双链DNA病毒,可引起鸡肝炎-心包积液综合征。为明确鸡cGAS(chcGAS)基因功能,探究在鸡肝癌(LMH)细胞中过表达chcGAS以及FAdV-4感染前后细胞定位的变化情况。本研究针对chcGAS序列设计引物进行PCR扩增,并分析该基因序列与其他物种之间的同源性以及预测该基因的结构域,构建重组质粒pET-32a-chcGAS进行原核表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用激光共聚焦观察FAdV-4感染LMH细胞前后chcGAS细胞定位变化。结果表明,本试验克隆得到大小为1317 bp的chcGAS基因,与其他物种同源性为50.5%~84.4%,SDS-PAGE分析结果显示,chcGAS蛋白主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达,目的蛋白质相对分子质量为75000,与预期大小相符。亚细胞定位结果显示,FAdV-4感染可导致定位于细胞核膜上的chcGAS蛋白转移到细胞质中。本研究结果为进一步研究FAdV-4与cGAS-STING信号通路的关联调控机制提供了科学依据。 展开更多
关键词 cGAS 血清4型禽腺病毒(FAdV-4) 序列分析 原核表达 亚细胞定位
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基于16S rDNA测序的巢湖流域水体粪便污染溯源 被引量：5
7
作者 祁钊 赵相龙 +4 位作者 桑金慧 何振杰 傅丹丹 岳振宇 宋祥军 《农业环境科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1128-1138,共11页
排入地表水中的动物粪便会带来一系列生态与公共卫生问题,快速准确鉴别污染来源对于源头控制与污染治理具有重要意义。基于细菌群落的微生物溯源技术(Community-based microbial source tracking)以及高通量DNA测序技术(Nextgeneration ... 排入地表水中的动物粪便会带来一系列生态与公共卫生问题,快速准确鉴别污染来源对于源头控制与污染治理具有重要意义。基于细菌群落的微生物溯源技术(Community-based microbial source tracking)以及高通量DNA测序技术(Nextgeneration sequencing,NGS),对污染源中微生物和环境样本中的微生物群落进行比较分析,进而对水体中粪便污染来源进行预测。本文利用16S rDNA测序,系统分析与比较了巢湖流域水体、沉积物样本与广泛的潜在污染源(包括村庄与养猪场污水,野生水鸟粪便,人类与家禽、家畜粪便)的细菌群落组成,同时,利用基于机器学习的溯源软件FEAST与Sourcetracker,对水体、沉积物样本的潜在污染源进行了预测。结果表明:水体与沉积物样本的微生物多样性显著高于粪便样本,其中巢湖水体与河流沉积物样本具有最高的物种多样性,同时样本中也存在大量未分类物种。变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes)广泛分布于所有样本中。溯源分析结果表明,村庄排污口与污水处理厂排污口样本是河水样本最主要的污染来源,沉积物与湖水样本则预测存在猪场排污水与野生水鸟粪便的污染,所有样本未检测到来自人粪与鸡粪的污染。 展开更多
关键词 16S rDNA测序 微生物群落 水体污染 微生物溯源
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血清4型禽腺病毒POCT荧光微球免疫层析检测方法的建立 被引量：3
8
作者 邵颖 肖福泉 +4 位作者 王丽丽 龚柳菲 宋祥军 涂健 祁克宗 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2022年第5期1298-1305,共8页
为了迅速且便利地判定血清4型禽腺病毒(FAdV-4),设计引物进行扩增,构建重组载体,原核表达的融合蛋白乳化后动物免疫得到多克隆抗体,用Western Blot检测,最后建立即时检验(POCT)荧光微球免疫层析试纸条,并进行初步应用。用POCT荧光微球... 为了迅速且便利地判定血清4型禽腺病毒(FAdV-4),设计引物进行扩增,构建重组载体,原核表达的融合蛋白乳化后动物免疫得到多克隆抗体,用Western Blot检测,最后建立即时检验(POCT)荧光微球免疫层析试纸条,并进行初步应用。用POCT荧光微球免疫层析试纸条检测不同浓度的FAdV-4病毒液及临床阳性样本,结果表明,用POCT荧光微球免疫层析试纸条15 min可以检测出结果,且检测出阳性,与临床诊断结果相符。建立的POCT荧光微球免疫层析检测FAdV-4的方法,特异性良好,操作简单且便于携带,检测效率高,有利于基层兽医临床检测。 展开更多
关键词 FAdV-4 hexon基因 原核表达 多克隆抗体 荧光微球免疫层析
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鸡DDX 41基因克隆表达、细胞定位及其在禽腺病毒4型感染调控天然免疫中的作用 被引量：1
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作者 刘琪 曹影丽 +6 位作者 魏宁波 杨侃侃 梁月巧 宋祥军 邵颖 涂健 祁克宗 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第5期1028-1036,共9页
为获得鸡DDX41(chDDX41)的原核表达蛋白,探讨chDDX41的细胞定位及其在禽腺病毒4型(FAdV-4)感染引起的天然免疫中的作用。根据GenBank中chDDX41基因序列,设计特异性引物,以LMH细胞cDNA为模板扩增,将扩增序列连接至pET-32a、pCAGGS-HA、pC... 为获得鸡DDX41(chDDX41)的原核表达蛋白,探讨chDDX41的细胞定位及其在禽腺病毒4型(FAdV-4)感染引起的天然免疫中的作用。根据GenBank中chDDX41基因序列,设计特异性引物,以LMH细胞cDNA为模板扩增,将扩增序列连接至pET-32a、pCAGGS-HA、pCMV-3×Flag和pmCherry-C1空载体,构建重组质粒。将pET-32a-chDDX 41转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达。利用激光共聚焦显微镜观察chDDX41在鸡肝癌细胞(LMH)和鸡巨噬细胞(HD11)中的亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测在LMH细胞中过表达chDDX 41对IFN-β等细胞因子表达量的影响。结果表明,克隆得到1854 bp的chDDX 41基因,共编码617个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白pET-32a-chDDX41主要以可溶性蛋白的方式在上清液中表达,经Western Blot鉴定,在90 ku左右有特异性条带,与预期结果一致;chDDX41在LMH和HD11细胞中主要定位在细胞核;FAdV-4感染过表达chDDX 41基因后的LMH细胞,发现IFN-β、IL-6、IL-1β和IL-8等细胞因子在mRNA水平上的表达量上调,表明chDDX41参与了FAdV-4引起的天然免疫应答。研究结果可为进一步研究DDX 41基因功能及其在天然免疫中的分子机制提供参考。 展开更多
关键词 chDDX41 原核表达 细胞定位 禽腺病毒4型 天然免疫
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